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Genome microbiome 원하는 클론 골라내기 유전자 DNA 검색 유전자 산물 단백질 직접 검색
2013-09-30 16:40:32

원하는 클론 골라내기

 
?내가 원하는 물질을 만드는 균주에 대하여 유전자 정보를 가지고 있다면, 이제 유전자 정보를 구성하는 수 천개 또는 수 만개의 클론들로부터 원하는 유전자가 들어있는 클론을 찾아내는 일이 남아있다.

 

여기에 원하는 유전자의 DNA를 직접 검색하거나 또는 유전자 산물 (대개는 단백질)을 직접 검색하는 방법이 있다.

 

유전자 DNA를 직접 검색하는 방법으로 콜로니 혼성화법(colony hybridization)이 있다. 이 방법에서는 검색도구로 원하는 유전자 DNA와 상보적 염기쌍을 만들어 붙을 수 있는 한 가닥 DNA가 필요하다. 이를 DNA 탐침(probe)이라고 한다. 이는 요즘은 이것의 합성을 전문적으로 수행하는 회사에 돈을 주고 맡기게 된다.? DNA 탐침에는 대개 방사능이나 형광으로 표지(labelling)를 하여 검출하기 쉽게 한다. 표지된 DNA 탐침이 얻어지면 콜로니 혼성화는 대략 다음과 같이 진행된다.

 

1. 원하는 균주의 유전자 도서관을 페트리 배양접시에 깔아 콜로니를 얻는다. 이 때 충분한 숫자의 콜로니를 검색해야 하며, 배양접시 하나에는 100-200 개 정도의 콜로니가 깔린 정도로 키우는 것이 좋다. 맨 처음에 깐 배양접시들을 마스터 플레이트(master plates)라고 한다.

 

2. 콜로니 위에 니트로셀룰로스나 나일론 막을 덮었다 떼어내서 콜로니의 패턴을 막에 옮긴다.

 

3. 막을 SDS와 같은 계면활성제에 처리하여 균주의 세포막이 녹아 DNA가 흘러나오도록 한다. 그러나 니트로셀룰로스나 나일론 막은 DNA 역시 강력하게 결합하기 때문에 세포가 녹아서 흘러나오는 DNA는 바로 콜로니 주변의 막 부분에 결합할 것이다.

 

4. 흘러나온 DNA가 이중나선 상태에서 단 가닥 상태로 풀어지도록 수산화나트륨을 처리한다.

 

5. 방사능이나 형광으로 표지된 DNA 탐침을 막과 반응시킨다. 탐침은 막에 달라붙어있는 DNA 중에 자신과 상보적으로 결합할 수 있는 부분을 가진 콜로니 위치에 가서 결합할 것이다.

 

6. 결합하지 않은 탐침을 제거하기 위해서 세척한다. 여러 차례 꼼꼼하게 잘 씻어내야 배경이 깨끗한 이미지를 얻을 수 있다. 씻은 막은 건조시켜 엑스레이 필름에 노출시킨다.

 

7. 현상시킨 엑스레이 필름의 이미지를 마스터 플레이트와 비교하여 탐침이 달라붙은 콜로니가 어느 콜로니인지를 알아낸다. 알아낸 콜로니를 대개는 한 번 더 새 페트리 접시에 스트리킹(streaking)한 후 콜로니 혼성화 법으로 조사한다. 잘 분리된 콜로니를 따서 그 속에 들어있는 유전자를 분석한다.

 

 유전자 산물인 단백질을 직접 검색하고자 하는 경우에는, 물론 사용한 벡터가 발현벡터이어야 하고, 그 단백질을 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 있어야 한다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)과 같은 원리에 의하여 막에 옮겨진 콜로니의 패턴에 대하여 항체를 이용하여 원하는 단백질이 발현되는 콜로니를 검색하여 찾아낼 수 있다.

 

출처

www.sunok.or.kr




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