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미생물이야기 그람 양성 세균의 대표주자 - Bacillus subtilis
2013-08-05 16:20:21
이엠생명과학연구원

그람 양성 세균의 대표주자 - Bacillus subtilis

 

 

 

 

 

B. subtilis의 유전자 지도

 


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B. subtilis의 일반적 형태

 

       Bacillus subtilis의 일반적 특성

 

  

 

B. subtilis는 흔히 '고초균'이라고도 하며 주로 토양 속에서 서식하며 Bacillus속에 속하는 균으로서 그람 양성(Gram positive)의 아포 형성 균이다. 호기성이며, 주모성 편모를 가지고 운동을 한다. 아포는 난원형이며, 중앙에 위치한다.

 

    또한 한국인에게는 청국장의 발효 미생물로서 관계가 깊을 뿐만 아니라 여러 미생물 제제로서도 이용되고 있다. 또한 유전공학에서 재 조합 DNA기술의 플라스미드(Plasmid)로서의 이용으로 매우 중요하게 사용되고 있다. 이는 플라스미드(Plasmid)는 유전 조작된 미생물 공정의 핵심 구성요소이기 때문이다. Bacillus는 이러한 플라스미드(Plasmid)에 사용되는 숙주(Host)로서 E. coli와 더불어 가장 많이 사용되는 균주이다. 이러한 B. subtilis의 게놈(genome)이 이제 완전히 밝혀진 것이다.

 

게놈 프로젝트

    게놈(genome)이란 한 생명체가 가지고 있는 전체 DNA를 말하는 것이며, '게놈'이란 용어는 'gene'과 'chromosome'의 합성어인 'genome'을 독일식으로 발음한 것으로 우리 나라에서는 '유전체'라는 용어로 통일하여 사용하고 있다. 따라서 '게놈 프로젝트'란 생명체의 DNA서열을 모두 밝혀내려는 것이다.

 

    DNA의 서열을 밝힌다는 것은 DNA를 이루는 물질인 당, 인산, 염기 중 염기의 서열을 알아낸다는 것인데, 이는 DNA를 이루는 단위(nucleotide)에서 당과 인은 항상 같은 형태로 존재하는 반면, 염기는 4가지의 다른 종류로 이루어져 있기 때문이며, 유전자의 특성은 각기 다른 염기의 서열에 의해 결정된다. 따라서 DNA상의 염기 서열을 밝혀내는 사업을 궁극적으로  '게놈 프로젝트'라 할 수 있다.

 

    게놈 프로젝트'는 다양한 생물체에 대해서 연구 중에 있다. 1995년 감기 바이러스인 'H. influenza'의 게놈 프로젝트가 완료된 것을 시점으로 이미 37종의 미생물체에 대한 게놈 프로젝트가 끝난 상황이다.

 

    그러나 이러한 미생물 중 그램 음성(Gram negative)이 대부분이고 또한, 사실 이러한 미생물중 인간에게 미치는 의학과 산업분야에서의 경제적인 측면에서의 가치가 불충분한 또한 사실이었다. 이에 B. subtilis 게놈 분석이 대두되었고, 이러한 공백을 채워 주게 된 것이다.

 

Bacillus subtilis DNA sequence의 일반적 특성

    B. subtilis는 4,214,810의 bp(base pair)를, 약 2,017 kb(kilo base)에 말단서열(terminus)을 가진다. 평균 G+C ratio는 43.5%이지만 이것은 염색체(chromosome) 마다 매우 다양하게 나타난다. leading strand와 lagging strand의 뉴클레오티드의 구성(nucleotide composition)의 비 대칭성을   G-C/ G+C의 상대적인 비의 역전이 복제 개시점에서 나타난다. 몇 군데의 A+T지역은 박테리오파지(bacteriophage)의 용원성 부위(lysogen)이거나 다른 요소(element)들의 삽입 결과로 나타난 것이다.

 

    일반적으로 다른 원핵생물(prokaryote)에서 나타난 것처럼 AA, TT, GC의 다이뉴클레오티드(dinucleotide)는 중첩되어 있고, TA, AC, GT의 다이뉴클레오티 (dinucleotide)는 감소되어 있다.

 

Bacillus subtilis 염기 서열 분석

    B. subtilis의 염기 서열 분석은 총8년 동안 진행되었다. 1990년 9월 유럽의 파스퇴르 연구소를 위시한 총 5개의 연구소가 고초균 프로젝트를  시작하였고 일년 후 일본이 그리고 가장 늦게 두 개의 미국 연구소와 우리나라의 생명공학 연구소(KRIBB)까지 총 21개의 연구소가 참여했다. 전체 4,214,814 bp의 전체 유전체중 유럽에서 2,667 kb(64%)를, 일본이 1,368 kb(32%), 한국을 비롯한 나머지 국가에서 186 kb(4%)를 담당해서, 23개의 단편(fragment)으로 나뉘어져 진행된 고초균의 유전체의 염기서열 분석이 1997년 7월 19일 완전한 B. subtilis(strain168) 유전체 염기 서열(genome seguence)로 9th International Conference on Bacilli (Switzland의 Lausanne)에서 발표되고, 1997년 11월 20일 " The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis"란 제목으로 저명한 과학잡지 네이처(Vol. 390: 249∼256, 1997) 에 실리게 되었다.

 

    B. subtilis는 유전자에 있어 중복성(duplication)의 과다분포를 가지는데 일부는 두 배 이상이 과잉되기도 한다. 예상하고 있던 rRNA gene은 그 주변의 유전자에서 발견할 수 있었고, 긴 염기 서열을 가진 반복 유전자(long sequence repeat gene)를 발견할 수 있었다. 또한 4,000여 개가 넘는 protein coding sequence(CDSs)가 밝혀졌다. 평균 size는 890 bp(base pair)이며, genome sequence의 87%를 차지한다. 또한 전사의 시작이 ATG에서 일어나는 경우가 78%, TTG에서 시작되는 경우가 13%, GTG에서 시작되는 경우는 9%(E. coli의 경우는 85% ,3%, 14%)이다. 15개의 gene은 특이한 start codon(ATT, CTG)을 가지고 있음이 밝혀졌다. CDSs는 세 개의 명확한 종류(class)로 분리된다.

 

    classⅠ은 B. subtilis gene이 대부분을 차지하며 포자 형성(sporulation)에 관여하는 대부분의 유전자들이 포함된다. classⅡ는 B. subtilis가 지수 함수적(exponential)으로 증가하는 조건 하에서 유전자 발현(gene __EXPRESSION__)이 잘되게 해주는 유전자, 번역(transcription)과 전사(translation)를 코딩(coding)해주는 유전자, 중간 대사(intermediary metabolism)에 관여하는 유전자, 스트레스 단백질(stress protein)을 발현시키는 유전자, 기능이 알려지지 않는 유전자의 1/3정도가 여기에 포함된다. classⅢ은 기능이 정확히 알려지지 않은 유전자(84%)가 매우 높은 비율로 차지하고 있으며 코돈(codon)에 A+T 잔 기들은 많이 가지고 있다. 이러한 유전자들은 15∼160gene사이에서 집단(cluster)을 이루며 그룹으로 존재하는 경우가 많다. 그리고 B. subtilis의 단백질의 58%의 기능(function)이 알려져 있고, 42%가 이미 알려진 단백질과의 유사성 비교로는 기능을 예측할 수 없었으며, 4%는 B. subtilis의 기능이 알려지지 않은 다른 단백질과 유사성을 보였고, 12%는 기능이 알려지지 않은 다른 종의 단백질과 유사성을 보였으며, 26%는 종래의 단백질과는 유사성이 전혀 없었다.

 

Bacillus subtilis 염기 서열 분석에 사용된 방법들

    고초균의 유전체 연구에 도입된 방법은 단백질 유전자 (Coding Sequences)분석에서는 리보솜(ribosome)의 결합 부위 신호를 이용한 시작 코돈의 조사(search for start codons preceded by ribosome binding sites signals), 구간적 Markov사슬을 이용한 유전자 표시 방법(GeneMark method of periodic Markov chains), BLASTX와 BLASTP에 의한 염기 서열 데이터 베이스 스캐닝(scanning), 작은 유전자 상에서와 시작 코돈의 부과에 의한 강조(emphasis on small genes and start codon assessment), 예상되고 있는 염기 서열 분석의 오류를 검색하기 위한 특성화된 과정의 개발(development of specialized procedures for detecting putative sequencing errors)이 있다.

 

    BLAST는 GenBank에 등록된 서열들과의 유사성 비교를 위한 프로그램으로 NCBI에서 개발된 대표적인 소프트웨어이다. 유사성 검사방법은 우선 검색을 원하는 서열 (query sequence)로부터 3개의 단백질 혹은 11개의 염기로 이루어진 단어들의 조합을 만든다. 만들어진 조합들을 각각 서열 데이터 베이스(database)의 서열들과 비교한다. 만약 각각의 단어 조합들과 같은 서열이 서열 데이터 베이스에서 발견이 되면 BLAST는 옆 단어들로 유사성 검색을 확장시켜 나간다. 이때 간격(gap)은 허용하지 않는다. 확장을 마친 후 데이터 베이스 서열 중 일정 값 이상의 HSP (High-scoring Segment Pairs)를 가진 서열들을 추출한다. 이때 중복되지 않는 각각의 HSP들은 통계적인 테스트를 거쳐 연결된다.

 

    이러한 BLAST의 프로그램(program)으로는 blastp, blastn, blastx, tblastn, tblastx등이 있는데 고초균의 유전체 연구에서는 단백질 서열간의 비교하는 blastp와 입력한 염기 서열을 6개의 단편(frame)으로 변환후 단백질 서열 데이터 베이스와 비교하는 blastx가 사용되었다.

 

    RNA 유전자들을 밝히는 방법으로는 이미 밝혀진 rRNA operons과 tRNA 유전자들을 위한 tRNA scan program, 단백질을 사용한 전사 종결자(transcription terminators)의 예상, 여러 방법의 통합과 사용한 이미지(image) 결과 등이 사용되었다.

 

Bacillus subtilis 염기 서열 분석의 의의

    과거 2년 동안 9개 유전체의 염기 서열이 완전히 결정되었지만, '그람 양성(Gram-positive)' 그룹의 세균들 중에서는 이번의 B. subtilis가 처음이다. 이로써 그람 양성 세균에 대한 연구가 활기를 띄게 되었다. 또한 이번에 진행된 유전체 연구에 의해서 심각한 질병들을 많이 일으키는 그람 양성 세균들에 대한 이해를 넓혀줄 것이다. 예를 들면, 디프테리아나 결핵, 폐렴과 같은 대부분의 심각한 전염병들은 모두 그람 양성세균들(Gram positive bacteria)에 의한 것이다. 또한 주로 병원에서 2차 감염의 주원인인 Staphylococcus aureus도 이 그룹에 속한다. 이 세균들 중 많은 것들이 현재 항생제에 대한 내성을 지니게 되어서 병원에서의 항생제 치료에 대한 심각한 위협이 되고 있다고 지적한다.

 

    이번 연구에서 중요한 발견은 B. subtilis가 몇 가지 방법으로 광범위한 외부 화학 물질들을 만들어내는 유전자들을 가지고 있다는 사실이다. 뿐만 아니라, 이들은 외부로 이들 화학물질들을 내보내는 정교한 기구들을 가지고 있다. 외부로 분비하는 기작은 그 산업적인 이용 가능성 때문에 연구자들이 많은 관심을 갖고 있는 분야이다. 즉, B. subtilis는 많은 양의 유용한 물질들을 분비하도록 조작될 수 있다. 이 기작은 보통 정상적인 환경에서는 독소들을 내보내기 위하여 사용된다. 예를 들면, Clostridum botulinum이 인간에게 치명적인 것은 세균 자체 때문이 아니라, 이들이 분비하는 강력한 독소(여태까지 알려진 것들 중에서도 제일 독성이 강함) 때문이다. 그래서 그람 양성 세균의 유전체에 대한 정보는 이러한 독소들의 분비를 막는 약을 디자인하는 데에도 도움을 줄 것이다.

 

    연구자들은 B. subtilis의 유전체 중에서 아직까지 다른 생물에서 보지 못했던, 완전히 새로운 4개의 유전자들에 관심을 갖고 있다. 이러한 현상은 새로운 유전체의 염기 서열이 결정될 때마다 되풀이되고 있다. 이는 우리가 아는 게 아직도 미미하며, 배워야할 많은 것들이 남아 있다는 사실을 보여준다 하겠다.

 

 관련 사이트

  * B. subtilis 일본데이터베이스: http://bacillus.genome.ad.jp/BSORF-DB.html\

  * 파스퇴르 연구소 B. subtilis 사이트
     http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/

     http://www.pasteur.fr/infosci/conf/AlgoBio/Bases_Mar99/exposes/moszer

  * 충북대 의학관련 사이트: http://medric.chungbuk.ac.kr/bioinfo/21001_2.html




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