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미생물이야기 최초의 숨겨진 실체의 발견 - Haemophilus influenzae
2013-08-05 16:34:37
이엠생명과학연구원

최초의 숨겨진 실체의 발견 - Haemophilus influenzae

 

 

 

    Heamophilus 속이란 어원은 혈액을 좋아한다는 말이란 뜻이다. 그러므로 H. influenzae, H. paraphilus, H. aphrophilus 등과 같은 세균들은 혈액에서 많이 기생하는 균들이다. 이들 중에서 우리는 최초로 DNA 시퀀싱(sequencing)에 성공한 H. influenzae에 대해서 알아보겠다.

 

    처음 이 자료를 조사하기 전에 바이러스 인플루엔자(virus influenzae)와 많은 혼란도 겪었으나, 여러 가지 자료들의 덕분으로 많은 도움이 되었고 뜻 깊었던 거 같다. 우리는 이 세균에 대하여 어떤 일반적인 특징에 대해서 논할 것이고, 그리고 그들의 DNA구조와 특징들에 대해서도 살펴 볼 것이다. 그리고 무엇보다도 그 수많은 미생물들 중에서 이 세균이 인간에게 어떠한 영향을 미치고, 우리 인간들의 올바른 대책에 대해서도 알아 볼 것이다.

 

어떻게 생겼을까?

    H. influenzae의 크기는 0.2∼0.3 ㎛ 또는 0.5∼2 ㎛ 정도이다. 이것은 다형적인 특징을 가지는데 대체로 작은 원모양이나, 필라멘트(filament) 모양처럼 길게 나타나는 모양도 취하고 있다. 위에 있는 그림은 초콜릿 배지에서 관찰한 H. influenzae의 모습이다.

    H. influenzae는 그램 음성(gram-)의 통성 혐기성 세균이다. 이들은 캡슐이 있어서 실험을 통해서 빛의 굴절을 야기 시킨다는 것을 발견했다. 이러한 캡슐은 리보스(ribose)와 리비톨(ribitol)의 인(phosphate)의 중합체(polymer)로 이루어져 있고, 그 구성 성분 및 항원형에 따라 a, b, c, d, e, f의 6가지 형태로 나눌 수 있다. 아래의 표는 각각 형태별, 생화학적 특징과 캡슐의 성분에 대하여 나타내고 있다. 이 중에서 사람에게 병원성이 가장 강한 것은 Type b형이다. 또, H. influenzae는 편모가 없는 소간균의 형태이다.

분류

indole

urease

ornithine decarboxylase

D-glucose
(only acid)

nitrate reduction

catalase

oxidase

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(H. influenzae의 생화학적 특성) - Kilian과 Biberstein으로 부터 채택

 

어떻게 살아가고 있을까?

V인자

X인자

이산화탄소 요구

용혈성

D-xylose부터의 산 유무

H. influenzae

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H. aegyptius

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H. ducreyi

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_

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+-

H. parainfluenzae

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H. parahaemolyticus

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H. paraphrohaemolyticus

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H. aphrophilus

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H. paraphrophilus

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H. segnis

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H. aegiptius

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    보통의 H. influenzae의 발육조건은 X인자(헤모글로빈과 결합되어 있는 헤민 성분)와 V인자(조 효소의 일종인 NAD또는 NADP) 두 가지를 꼭 필요로 한다. 여기서 헤민 성분은 시토크롬(cytochrome)과 촉매효소 (catalase)의 합성에 꼭 필요한 성분이고, NAD또는 NADP는 자체 합성이 가능하다. 위에 나타난 것처럼 H. influenzaeHeamophilus 속에 균들은 X인자와 V인자가 매우 중요한 요소이다.

 

    H. influenzae 배양 시 혈액 한천 배지에서는 발육이 빈약하므로 헤모글로빈을 첨가하거나 또는 혈액을 가열하여 만든 초콜릿 한천 배지를 사용하는 것도 위와 같은 이유여서 이다. H. influenzae는 통성 혐기성이므로 산소가 없을 때에는 N을 마지막 전자 수용체로 사용한다는 것이 또 다른 특징이다.

 

    H. influenzae는 탄수화물을 이용하지 못하기 때문에 당 발효 반응으로 그 세균을 관찰하거나 검사하는 것은 불가능하다. 그래서 흔히 쓰이는 관찰법으로는 ELISA방법으로써 형광 물질로 labeling된 antibody를 이용한다. 또 혈액 한천 배지 배양을 하면 관찰이 용이한데 보통은 Staphylococcus 근처에서만 발생한다. 이것은 hemotytic staphylococcus가 적혈구로부터 X와 V인자를 노출시키기 때문이다.

 

숨겨둔 DNA의 실체는 어떠할까?

    H. influenzae는 Robert D  Fleischmann연구팀에 의해 이루어진 최초로 완성된 DNA 시퀀싱이다. 그러므로 그 의미는 매우 크다고 할 수 있다. 우리는 이러한 DNA 시퀀싱으로 인해서 병원균으로써 좀 더 올바른 이해와 병의 예방에 있어서 중요한 역할을 할 것이다.

 

    먼저, H. influenzae의 DNA 시컨싱은 λphage를 사용해서 형질도입법에 의한 유전자 지도 작업이 있고, 또 제한 효소에 의해 전체 DNA를 무작위적(random)으로 잘라서 시퀀싱하는 방법을 사용했다. 그 전체적인 유전자의 특징과 각 부위별 포함하고 있는 정보에 physical-map대한 것은 그림에 나타내고 있다.

    이 한 가닥의 환상형 DNA의 구조를 설명하면 다음과 같다.가장 바깥쪽에서부터 첫 번째 동심원은 유전자의 전체적인 구조적인 특성을 색깔별로 구분한 것이다. 두 번째 동심원은 높은 G+C비율과 A+T비율을 나타내는데 G+C비율은 빨간색 부분이 42%이상, 파란색 부분에서는 40%이상을 차지하고 있으며, A+T비율은 검은색부분이 66%이상, 녹색부분에서는 64%이상을 나타내고 있다. 세 번째 동심원은 300개의 λclone이 각 끝에서부터 시퀀싱 됐는데 이것은 게놈의 전체 구조를 확인하기 위해서 실시된 것을 나타내고, 네 번째 동심원은 각각 6개의 리보솜 오페론(녹색), tRNA(검은색)을 표현하고 있다. 다섯 번째 동심원은 CTGGCT, GTCT, ATT, AATGGC, TTGA, TTGG, TTTA, TTATC, TGAC, TCGTC, AACC, TTGC, CAAT, CCAA의 반복되는 염기를 나타낸 것이고, 마지막 동심원은 DNA복제가 603,000base 근처의 origin에서 시작되어 화살표 방향(녹색)으로 개시되는데, 가능한 종결부위는 반대편의 두 개의 지점(빨간색)이다.

 

     이 세균은 전체가 1,830,137개 염기 쌍(base pair)의 크기이고 환상형(circular) 염색체(chromosome)이다. G+C의 비율이 전체적으로 38%로 비교적 높다. 특히 높은 부분은 6개의 rRNA 오페론(operon)정보를 포함하는 부위이며, 염색체내 삽입된 mu의 일종의 phage DNA가 발견된다. mu bacteriophage에 의해 인코드 되는 단백질과 비슷한 단백질이 위 그림에서 이 게놈의 1.56~1.59 M base pairs정도 사이에서 존재한다. 이 지역은 특히 G+C 비율이 높다. 여기서도 G+C 비율이 38%이다.

 

    대장균의 경우 복제 기점(replication origin)은 최초 DNA 풀림(unwinding)을 위한 3개의 13 bp 반복구조와 DnaA결합 부위 및 복제 시작 부위인 4개의 9 bp 반복구조를 포함한 245 bp로 이루어진 부분이다.

 이와 같이 H. influenzae Rd도 비슷하여 3개의 13 bp 반복구조와 4개의 9 bp 반복구조를 포함한 280 bp로 이루어져 있다. 이 부분(origin)은 리보솜 오페론(ribosomal operons: rrnF rrnE rrnP origin rrnA rrnB rrn rrnC)의 세트(sets) 사이에 있다.

 

    이 두 그룹의 오페론(operon)은 반대 방향으로 전사되며, 그 기점(origin)의 배치는 전사의 방향성과 같다. 대장균 복제 종료는 2개의 복제 포크(replication forks)가 만나는 중간지점의 양편 중 하나에서 약 100 K. bases 정도에 위치한 2개의 23bp 종결 시퀀스(termination sequences)로 이루어져 있다. 대장균의 이 2개의 잠재적인 종결 시퀀스(termination sequences)는 동일한 10 bp의 코어 시퀀스(core sequences)를 가지고 있다. 그리고 이 2개의 종결 시퀀스(termination sequences) 역시 H. influenzae와 동일했다.

 

    이 2개의 종결 시퀀스는 H. influenzae의 복제 기점의 180°반대의 위치에서부터 약 100 bp 정도 떨어져 있다. 6개의 rRNA 오페론은 동일했다. 차례로 각각 3개의 subnits와 그사이에 시퀀스가 다양한 spacer regions를 포함하고 있다(16s subunit-spacer reigion-23s subunit-5s subunit). 이 subunit의 길이는 각각 1539, 2653, 116 bp였다. 위의 3개의 ribosomal subunits의 G+C비율(약50%)은 전체 게놈의 G+C의 비율보다 높았고, 스페이스 부위(space region)의 G+C의 비율(38%)은 전체 게놈의 G+C의 비율과 동일했다. 이 3개의 rRNA subunits의 염기서열은 6개의ribosomal subunits에서 완전히 동일했다.

 

어떻게 염기 서열을 분석하였을까?

    지금부터 염기서열 분석법에 대해서 살펴보겠다. 여기서 H. influenzae Rd 균주의 염색체 DNA를 기계적으로 부수고, BAL 31 핵산분해효소(nuclease)로 이 DNA를 처리해 blunt ends를 만든 후 아가로스 겔 전기영동(gel electrophoresis)으로 크기별로 나누었다. 그 크기가 1.6 kbp에서  2.0 kbp 사이의 단편을 절단 후 따로 모았다. 이렇게 좁은 범위의 DNA를 선택한 이유는 복제 중의 다양화를 최소화하기 위해서 이다. 그뿐 아니라, 이 실험에서 이 좁은 범위는 최대 크기의 유전자가 포함될 수 있게 정한 것이다. 그러나, 하나의 단편 속에 존재할지도 모르는 유전자의 발현 가능성을 막기 위해서 이다. 왜냐하면, 그 유전자 산물의 발현이 DNA단편의 영향을 끼쳐 유전자의 손실을 일으킬 수 있기 때문이다.

 

    이 단편들은 SmaI-cut, 포스포타아제(phosphotase)를 처리한 pUC18 벡터에 삽입 시켰다. 그리고 이 삽입된 산물을 아가로스 겔에서 분류되었다 그리고 linear vector plus(와) 삽입된 band는 절단 후 다시 회수되었다. 이 linear recombinant 분자의 끝은 T4 중합효소(polymerase)로 복구(repair)된 후, 이 분자는 다시 원형 형태로 삽입되어 만들어졌다. 이 두 절차로 인해 두 번 삽입된 DNA 결과물(double - insert chimeras ; 1%미만)와 원하는 DNA가 삽입되어 있지 않은 벡터(free vector ; 3%미만)를 최소로 가지는 단 하나의 유전자만 삽입된 벡터를 얻을 수 있다. 이 무작위적인 방법으로 인한 오류는 복제동안 일어날 수 있기 때문에 재조합(recombination)과 제한(restriction)기능이 결핍된 대장균 숙주세포를 사용하였다. 그 이유는 제한효소에 의한 복제물의 손실 및 재배치, 결손을 막을 수 있기 때문이다.

 

H.influenzae는 왜 두려운 존재일까?

    H. influenzae는 사람을 숙주로 하여 여러 가지 질환 등을 야기 시킨다. 아래 표는 나이에 따라 H. influenzae의 감염정도를 나타낸 것인데, 어린 나이일수록 감염도가 높다는 것을 알 수 있다.

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    위의 표는 Heamophilus별로 많이 발생되는 병들을 나타낸 것이다.  생후 6개월에서 3살 사이에 내막 염을 발생시키고, 군인이나 2세 이하의 아이의 볼에 감염하여 봉와직염을 유발한다. 그밖에 후두개염으로 인한 급성 호흡장애 및 기관지염, 수막염, 중이염 등의 질환에 관여하고 있다. 아래의 그림은 사람의 인체에 발병되는 균의 모습들을 나타내고 있다.

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    H. influenzae는 병원성을 유발하는 세균으로써 인간에게 매우 위험한 존재이다. 이들을 방어하기 위한 방법으로써는 현재 백신을 만들어서 예방하는 것을 제외하고는 빈약한 상태이다.

 

    그러나, DNA 시퀀싱을 통한 많은 연구는 H. influenzae가 인간에게 두렵지 않은 존재로 다가올 것이며 머지 않아서 이들은 박멸될 것이라 믿는다. 나는 이번 조사를 통해서 DNA 시퀀싱에 대해 약간의 이해심을 가질 수 있었으며, 그 중요성도 느낄 수 있었다. 그리고 평소에 관심이 부족했던 H. influenzae란 세균에 대해서 많은 지식을 쌓을 수 있어서 누구보다도 이 세균에 자신감을 가질 수 있어서 매우 뜻 깊었다. 한편, 이 세균에 대한 자료를 조사하면서 많은 책들을 살펴보았으나, 제대로 된 한글판이 하나도 없었다는 점에서 우리 나라의 과학 현실에 아쉬움이 많이 남았다.

 

 관련 사이트 및 참고 자료

  * SCIENCE vol.269 28July 1995.

  * www.samber.ebr.ac.uk/genequiz//genomes/hi/

  * www.tigr.org/tdb/mdb/hidb/hidb.html




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