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미생물이야기 결핵 해결의 열쇠는 유전자에 있다! - Mycobacterium tuberculosis
2013-08-05 16:43:28
이엠생명과학연구원

결핵 해결의 열쇠는 유전자에 있다! - Mycobacterium tuberculosis

 

 

    마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 결핵을 일으키는 결핵균이다. 이 균은 초기에는 체내 방어기작에 의해 잠식되는 듯 하지만, 체내에서 잠복하고 있다가 면역계가 약해지면 다시 증식하여 결핵을 일으키므로 그 치료가 어려웠다. 그 동안 결핵퇴치를 위해 노력한 결과 BCG백신과 여러 가지 화학적 치료를 개발하게 되었고 이로 인해 환자수가 많이 줄어들었으나 세계보건기구(W.H.O)의 보고에 따르면 전세계 결핵환자수가 95년 297만 7천명에서 2000년 350만 9천명으로 다시 증가하고 있으며 해마다 200만 명 이상의 사람들이 결핵으로 죽어가고 있다고 한다. 이런 최근의 결핵환자의 증가는 결핵균의 대한 감시를 늦추어서는 안 된다는 경고 등이다. 또 최근의 결핵환자들은 약제저항성 균주에 의해서 결핵에 걸리는 비율이 높아지고 있기 때문에 결핵균에 대한 새로운 접근이 필요하다. 즉 결핵의 치료를 위한 새로운 방법이 필요하다는 것이다. 이번 M. tuberculosis의 DNA분석은 결핵균에 대한 보다 본질적인 이해와 그것을 바탕으로 한 결핵의 새로운 치료방법에 대한 아이디어를 제공하고 있다.

 

결핵균 유전체 연구자와 그 방법

    이번 게놈(genome)분석은 영국의 쌍거 센터(sanger centre)에서 스테워트 콜 박사(Dr. Stewart Cole)가 이끄는 게놈 연구팀에 의해 이루어졌다. 게놈분석 대상으로는 M. tuberculosis H37Rv 균주가 사용되었으며, 그 방법으로는 코스미드(cosmids)와 BAC(bactrial artificial chromosome: 세균의 인공 염색체) 클론이 사용되었다. 이 방법은 일종의 유전자 사전으로서 이미 밝혀져 있는 게놈 서열인 코스미드나 BAC의 클론과 분석하고자 하는 게놈의 상동성을 통해 게놈서열을 알아내는 방법이다. 이번에 사용된 코스미드나 BAC는 샷건 방법보다 크기가 큰 클론으로 보다 긴 단편의 염기서열을 파악 할 수 있게 해준다. 이번 연구에서는 프랑스의 파스퇴르 연구소에서 코스미드와 BAC를 지원했다.

 

M. tuberculosis의 일반적인 특징

    M. tuberculosis는 크기가 0.2∼0.5×1∼4 ㎛ 정도 되는 간균으로, 아포를 형성하지 않고, 편모가 없으며 가늘고 길쭉한 형태이다. 이 균은 그램 양성균으로서 호기성이며 세포벽의 많은 지질 때문에 항산성을 띤다. 분열증식한 균은 균집락을 이루는데 이것은 균이 서로 엉겨 붙어 새끼줄처럼 보이는 균삭을 이루고 이 균삭의 형태로 결핵을 유발하게 된다.

 

M. tuberculosis의 게놈 분석 결과

    게놈의 크기는 4,411,519 염기쌍으로 세균에서는 Escherichia coli 다음으로 큰 게놈 사이즈이며 염기의 G+C비율(Guanine + Cytosine cotent)은 65.6%로 매우 높은 편이다. 그림1은 M. tuberculosis의염색체 써클 맵(circular map)이다.

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그림1. M. tuberculosis의 염색체 써클 맵  

    가장 외곽원은 염색체의 크기를 Mb단위로 나타내고 있고 복제 기점을 0으로 표시하고 있다. 첫 번째 원은 안정한 RNA분자를 가리키고 있으며, 두번째 원은 DNA가닥 위의 코딩부분을 나타내고 있다. 세 번 째 원은 DNA상에 반복되어 나타나는 부분을 나타내고 있고, 네 번째와 다섯 번째원은 각각 PE페밀리와 PPE페밀리를 나타내고 있다. 여섯 번째 원을 PGRSs,부분을 나타내고 있으며, 가장 안쪽의 히스토그램은 G+C비율을 나타내고 있는데 65%이하는 노란색으로 65% 이상은 빨간색으로 나타내고 있다.

(nature/vol 393/pp.538 11 JUNE 1998 )

 

발견된 RNA유전자

    M. tuberculosis에서 안정한 RNA유전자는 약 50개가 발견되었다. 이 RNA유전자는 rRNA유전자 3개, tRNA유전자 45개, 그리고 10SaRNA유전자 1개와 RNaseP유전자 1개이다. 이들 중 rRNA는 rrn 오페론이라고 불리는 특별한 리보좀 RNA 오페론에 의해서 16s RNA, 23s RNA, 5s RNA가 동시에 만들어지는데, 이 오페론은 복제시점에서 약 1500kb 떨어진 곳에 위치하고 있다. 그리고 10SaRNA는 비정상적인 mRNA에 의해 만들어진 결여단백질들의 분해에 관여하는 RNA이고, RNaseP는 RNA의 분해에 관여하는 RNA이며 각각 3400kb와 2500kb정도에 위치한다. 나머지 tRNA유전자들은 게놈 전체에 골고루 분포하고 있다.

 

M. tuberculosis의 주요대사인 지질대사와 관련한 유전자

    M. tuberculosis는 숙주 내에서 주로 숙주의 세포막지질성분을 이용해서 살아간다. 그 때문에 지질분해 대사에 관여하는 유전자를 많이 포함하고 있다. 탄수화물 분해 효소 유전자가 22개이고 아미노산 분해효소 유전자가 18개인데 비해 지질분해효소 유전자가 119인 것을 보면 이들이 얼마나 지질대사에 큰 비중을 두는지를 알 수 있다.

 

    그림2의 a는 결핵균이 이용하는 대표적인 지질대사 경로로서 숙주의 세포막에서 acyl-CoA를 β-산화를 통해 acetyl-CoA로 전환하여 이용하는 과정을 나타내고 있는데, 여기에서 β-산화과정에서 쓰이는 여러 가지 효소를 코드하고 있는 일련의 유전자들을 볼 수 있다. 이들은 이 산화과정을 이루어지게 하는 효소를 만들어서 이 산화과정이 이루어 질 수 있도록 한다. β-산화를 통해서 만들어진 acetyl-CoA는 accA1 등에 의해서 탄소가 첨가되어지면 결핵균의 세포벽이나 지질성분으로 사용되고,  TCA회로나 글리옥실산 션트(glyoxylate shunt)를 통해서는 에너지원으로 혹은 생합성의 전구체로 사용된다.

img27

          그림2. 지질대사

                   a.숙주세포의 지질을 분해하여 M. tuberculosis의 생장에 필요한 물질을 얻는 과정

                   b. 마이콜린산을 합성하는 유전자

                   c. 프티오세롤 디마이코세로산(phthiocerol dimycocerosate) 을 합성하는 유전자들

                   (nature/vol 393/pp.540 11 JUNE 1998)   

 

외피구조의 생산에 관여하는 유전자들

    M. tuberculosis의 외피는 두꺼운 지질층으로 구성되어 있어서 산성에 견딜 수 있도록 하는 역할을 하고, 다양한 표면구조를 통해 항원을 제공한다. 또 외피구조의 지질층 자체가 약제의 침투를 막는 역할을 하고 있어서 약제 저항성에도 영향을 주고 있다. 이러한 외피구조는 많은 단백질과 지질성분을 포함하고 있는데, 지질성분 중에 특이한 마이콜린산(mycolic acid)를 포함하고 있다. 이 마이콜린산은 이들이 균삭의 형태를 이루는데 중요한 역할을 하는지질성분으로서 마이콜린산의 끝부분에 탄소 세 개로 구성된 고리구조가 균삭 형성에 핵심적인 역할을 하고 있다. 그림-2의 b는 마이콜린산을 합성하는 유전자들을 나타내고 있는데 그중 cmaA1과 cmaA2가 바로 지질분자 끝의 탄소고리구조를 형성하는 유전자이다. 따라서 이들 유전자에 이상이 생길 경우 마이콜린산 지질분자에 변형이 생기게 되고, 그에 따라 균삭을 제대로 형성하지 못하여 병원성도 떨어지게 된다.

 

다양한 항원을 제공하는 단백질 분자들

    이번 게놈 분석에서 전체 게놈의 10%의 큰 비율을 차지하는 반복구조의 단백질 유전자군(gene family)이 발견되었다. 이들은 PE페밀리, PPE페밀리 라고 이름지어졌다. 이들은 G+C비율이 높은 단백질을 코드하고 있는 유전자들이며, 여기에서 생성된 단백질들은 면역적인 특이성과 다양한 항원을 제공하는 역할을 하는 것으로 나타났다.

 

    아래의 그림-4는 이 PE와 PPE단백질 유전자군의 모습을 나타내고 있다. PE는 그 단백질의 N말단에 프롤라인(Pro)-글루타민(Glu) 부분을 가지고있다고 해서 이름지어졌는데 이들은 그 아군으로 PGRSs(polymorphic G+C-rich sequences)를 가진다. 이 아군은 글리신(Gly)-글리신-알라닌(Ala)이나 글리신-글리신-아스파라긴(Asn)의 반복되는 구조가 나타나고 있다. PPE는 단백질의 N말단에 프롤라인-프롤라인-글루타민의 구조 때문에 PPE로 이름 지어졌으며 그 아군으로 MPTRs(major polymorphic tandem repeats)를 가지고 여기에는 아스파라긴-X-글리신-X-글리신-아스파라긴-X-글리신이 반복되는 구조가 나타나고 있다.

 

    이들 단백질군은 다양한 항원을 형성함으로 인해서 결핵균의 병원성을 상승시키는 역할을 하고 있으며 이웃 균종들 간에 나타나는 단백질군의 염기서열차이는 그 항원의 다양성을 더욱 증가시킨다.

 

    그림3의 b는 M. tuberculosisM. bovis BCG간 PE-PGRS유전자군을 비교하여 나타낸 것이다. 그림에서 H37Rv균주는 BCG균주에서 발견되지 않는 46개 염기쌍을 더 가지고 있으며, M. bovisM.tuberculosis보다 29개의 염기쌍이 더 많다. 이러한 균종들간의 차이는 항원단백질에 다양성을 증가시키고 있다.

 

독성인자

    독성인자를 코드하고 있는 유전자가 38개 발견되었다. 이 독성인자들은 항원을 형성하는 단백질들과 함께 병원성에 관계하고 있다. 이 중 주목할 만한 유전자는 mce1,mce2, mce3, mce4로 이들은 세포표면에 보내질 단백질을 생산하는 유전자들이다. 이 유전자에서 생성된 단백질은 세포 표면에 노출되어 숙주세포를 침입하는데 관여함으로써 결핵균의 병원성에 관여한다. 그 외에 여러 프로타아제와 포스포리파아제C, 리파아제와 에스테라제, 등도 독성인자로 작용한다.

 

삽입서열(Insertion Sequence: IS)

    그 외에 주목할 만한 유전자로는 삽입서열(Insertion sequence: IS)을 들 수 있다. 삽입서열이란 본래 스스로 가지고 있던 유전자가 아닌 다른 세균 등에서 전해져 들어온 부분을 말한다. 따라서 삽입서열이 많이 나타나는 것은 이 결핵균이 다른 균주들과의 유전자교환이 많았다는 것을 의미한다.

    M. tuberculosis에서 나타난 삽입서열은 IS6110이 16번 카피되어 나타나고, IS1081이 6번 반복해서 나타난다. 그 외에도 IS1561, IS1552, IS3, IS1532등의 삽입서열들이 관찰되었다. 이러한 삽입서열들은 대부분 인터제닉(intergenic)이나 코드 되지 않은 부분에서 많이 발견되고 종종 tRNA근처에서 발견되며 유전자의 불활성을 막는 삽입 hot-spot도 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.

 

약제저항성 기작

    최근 결핵환자들에게는 약제저항성 결핵균들이 검출되고 있다. 이들은 약제에 대해서 민감하게 반응하지 않는 균들을 말하는 것으로 그 첫 번째 이유는 바로 두꺼운 외피구조이다. 이들의 외피(cell envelope)는 소수성이 높은 지질성분이 두껍게 가지고 있기 때문에 삼투에 대한 방어벽 역할을 할 수 있다. 그러나 이와 같은 외피구조가 물론 일차적인 방어벽이 되기는 하지만 약제에 저항할 만한 충분한 조건은 아니다.

 

    M. tuberculosis는 약제 가수분해 효소와 약제를 수식효소를 가지고 있어서 이들을 통해 약제를 무독화 시킬 수 있는 여러 가지 효소들을 생산하여 보다 본질적인 약제 저항성을 갖추게 된다. 예를 들면 β-락타마제나 마이노 글리시드 아실 트랜스퍼라제 등이 그러한 효소들이다. 또다른 약제저항 메카니즘으로는 잠재적인 약제 유출 시스템을 들 수 있다. 이것은 ABC운반체 등에 의해서 약제를 세포 밖으로 내보내는 작업으로 약제 저항성을 이루는 보조 역할을 하게 된다.

 

최근의 연구방향

    최근 미국 알버트 아인슈타인 의과대학의 윌리암 제콥스 박사를 비롯한 연구팀은 결핵균의 외피 지질성분인 마이콜린산 지질분자의 끝에 형성되는 고리모양을 형성하지 못하도록 하면, 균삭형성을 방해함으로써 결핵균을 제어 할 수 있다는 것을 알아내었다.  또 제이 콥스 박사팀은 내성 결핵균에서 마크로 파지 안에 숨어 면역계 공격을 피할 수 있도록 해주는 효소를 발견하여 그것을 제거하면 결핵균의 내성을 막을 수 있다는 것도 알아냈다.

 

    이렇게 최근에는 결핵균의 생존에 필수적인 고분자 합성에 관련한 유전자의 저해나 병원성 관련 유전자를 저해하여 결핵균의 증식을 막는 방법으로 주로 연구가 진행되고 있다.

 

    한편, DNA를 이용한 또 다른 결핵 퇴치방법으로 삽입서열을 이용하는 것이 있다. 이 방법은 각 결핵균들을 게놈 분석하여 각 결핵균들의 삽입서열 지문 양상을 파악한 다음 이 지문양상들의 비교 분석을 통해 균의 유입과 전파경로를 파악하는 것이다. 그러한 방법은 삽입서열의 종류와 그에 따른 형태적 차이가 균주 또는 결핵균 균종간의 병원성과 감염력의 차이와의 관련여부 등을 분석하여 이 정보들을 결핵관리에 활용할 수 있다. 이미 선진국에서는 IS6110을 이용한 결핵균주 분류기법이 이용되고 있는 것으로 알려져 있다.

 

앞으로의 연구 방향

    이번 연구의 목적은 결핵균의 게놈에 대한 보다 폭넓은 지식의 확보였다. 그 결과 이번 연구에서는 결핵균에의 병원성 관련 유전자들, 저항성 유전자, 항원형성 유전자, 생존에 필수적인 대사에 관련한 유전자 등 결핵균에 관한 새로운 정보들을 많이 확보하게 되었고, 또 유전자의 연구를 통해 결핵치료개발까지 이어질 수 있는 유전자들의 발견도 많았다. 그것을 바탕으로 해서 연구가 진행중인 경우도 있었다. 이제 그것을 실제 치료약으로 사용이 가능하도록 하기 위해서는 먼저 그 유전자로부터 형성되는 단백질을 연구하고 그것을 불활성화 시킬 수 있는 기술을 찾아내는 일일 것이다.

 

    또다른 연구방향으로는 게놈 분석을 통해 결핵 균주를 진단하는 방법을 개발하는 일을 들 수 있다. 게놈 분석을 통해서 각각의 게놈 특성을 입력하여 결핵균주를 검출해 낼 수 있게 되면,  결핵이 발생했을 때 어떤 균주에 의해서 발병했는지를 빨리 찾아내고 그 균주의 특성에 맞게 결핵치료를 설계할 수 있기 때문에 결핵치료에 도움을 줄 수 있을 것이다. 결핵을 완전히 정복할 수 있는 날이 오기를 기대한다.

 

 관련 사이트 및 참고자료

  * 영국 sanger centre : www.sanger.ac.uk

  * nature vol 393/11 JUNE 1998




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