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미생물이야기 식물병원세균의 분리
2013-08-05 17:19:30
이엠생명과학연구원

식물병원세균의 분리

 

가. 분리배지

  

식물세균병을 진단하기 위하여 병원세균을 분리할 때 배지선택이 중요하다. 병든 식물체 조직에서 병원세균을 분리할 때 2~3종의 배지를 함께 사용하는 효과적이다. 경험이 미숙한 초보자의 경우에는 반드시 대조균주를 함께 배양하여 균총 특성을 비교해야 한다. 대부분의 식물병원세균(Acidovorax, Agrobacterium, Burkholderia, Erwinia, Ralstonia, Xanthomonas속)은 NBY(Nutrient broth-yeast extract agar) 또는 YDC(Yeast extract-dextrose-calcium carbonate agar)와 같은 일반 세균용 배지에서 생육이 양호할 뿐만 아니라 병원세균속에 따라 특이한 균총을 형성한다. 그러나 일부의 속, 종, 계통은 사용하는 배지에 따라 생육과 균총 형성에 많은 차이가 있다. 세균에 따라 YDC에서는 생육이 불량하지만 NBY에서 생육이 양호한 세균(P. stewartii, X. oryzae), YDC와 NBY에서는 생육이 불량하지만 NA(Nutrient agar)에서 생육이 양호한 세균(Xylophilus ampelinus), KB(King's B)에서 생육과 균총이 양호한 세균(Pseudomonas spp.), NBY에서 생육과 균총이 양호한 세균(Clavibacter spp.) 등이 있다. 또한 Bacillus, Clostridium, Streptomyces 등으로 의심될 경우에는 적합한 배지를 추가로 사용하는 것이 효과적이다.

나. 분리방법

  

병원세균을 분리하는 방법은 이병식물체의 종류, 형성된 병징, 감염토양 등에 따라 다양한 방법이 있다. 일반적으로 이병된 식물체 조직으로부터 병원균을 분리하는 방법은 다음과 같은 방법을 많이 사용한다. 먼저, 소독한 칼을 이용하여 병이 진전되고 있는 부분의 조직을 적절한 크기(3~5㎜)로 절단한다. 절단된 조직은 멸균수를 이용하여 깨끗이 씻거나, 소독액(1% 차아염소산칼슘, 1% 차아염소산나트륨 용액)을 이용하여 2~3분간 침지하면서 표면소독 한다. 소독된 조직을 멸균수에 2~3회 씻어낸 후, 작은 시험관에 소량의 물(0.5㎖)과 조직을 함께 넣고 소독한 칼로 잘게 자른다. 칼로 절단하기 어려운 조직은 유발과 유봉을 이용하여 마쇄한다. 2~3분간(경우에 따라서는 30분) 정치한 후 루프(Platinum wire loop)를 이용하여 마쇄액을 적절한 고체배지(NBY, YDC, KB)에 배양(streaking) 한다. 25~28℃에서 2~3일 배양 후 생육한 균총을 확인한다. 종동정이나 분리세균을 다른 목적으로 이용할 경우에는 생육한 균총을 선별하여 순리분리 과정을 수행한다. 경우에 따라, 식물 세균병에 감염된 조직이지만 일반적인 분리방법으로 분리되지 않는 경우도 있다. 이런 경우에는, 병원세균이 혐기성세균(Clostridium spp.), 생육이 아주 느린 세균(Xylella fastidiosa, Rhozomonas) 또는 인공배양이 불가능한 세균(Liberobacter spp.) 여부를 확인해야한다.

1. 식물병원세균의 동정

 

   식물병원세균은 크게 2가지 집단으로 구분할 수 있다. 첫째는 일반 세균용 배지에서 분리와 배양이 용이한 세균(Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces, Ralstonia, Xanthomonas 등)이고, 둘째는 일반 세균용 배지에서 분리와 배양이 잘 되지 않거나 전혀 생육하지 않는 세균(Spiroplasma, Rhizomonas, Xyella fastidiosa 등)이다. 첫번째 집단에 소속되는 식물병원세균들은 일반적인 세균용배지에서 인공배양이 용이함으로 배양적, 형태적, 생리·생화학적특성을 조사하고 분류책자를 이용하여 비교함으로써 상대적으로 쉽게 동정할 수 있다. 동정시 가장 중요한 점은 오염되지 않은 순수배양된 세균을 사용해야 하며, 대조균(정확히 동정된 세균이나 분양 받은 균주)을 사용하여 항상 비교해야한다. 또한 대부분의 식물병원세균은 그람음성이기 때문에 그람반응(Gram reaction) 조사는 초기 동정에서 가장 중요하다. 최근에는 자동화 동정 기술(지방산분석, Biolog, ELISA kits)과 분자·혈청학적 기술들이 개발되어 세균동정에 유용하게 사용되고 있다. 그러나 식물병원세균의 정확한 동정을 위해서는 세균학적특성, 병원성, 자동화 동정기술 및 분자·혈청학적기술 등 다양한 방법으로 비교 검토해야만 동정의 오류를 막을 수 있다. 두번째 집단에 소속되는 세균들은 첫번째 집단의 세균들과 달리 특별한 배지에서 생육특성이나 형태를 조사해야 하며, 배양이 불가능한 경우에는 전자현미경을 이용한 형태적특성과 분자·혈청학적기술을 이용하여 동정한다.

표 1. 주요 식물병원세균 속의 구분

그람반응

배양적 특성

식물병원세균 속

음      성

양      호

불      량

Acidovorax, Agrobacterium, Burkholderia, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, Xylophilus
Rhizomonas, Xylella

양      성

양      호
배양안됨

Bacillus, Clavibacter, Clostridium, Streptomyces
Rickettsia like bacteria(RLB)

기      타

불      량
배양안됨

Spiroplasma
Phytoplasma

주) 배양적 특성 : 일반 세균용배지(NBY, YDC, KB)에서의 생육상태

참 고 문 헌


조용섭 외. 1999. 식물세균병학. 서울대학교 출판부.
Ohata. et al. 1995. Methods for Isolation, Cultivation, Inoculation of Plant Pathogens. JPPA.
Shaad. et al. 2001. Plant Pathogenic Bacteria. APS Press.




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