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미생물이야기 세균균주 관리
2013-08-06 12:46:00
이엠생명과학연구원

세균균주 관리

 

환경분야에서 가장 중요한 세균은 유기물질 처리에 관여하는 세균과 병원성 및 지표성세균으로 이들이 주로 속하는 호기성 혹은 통성혐기성 종속영양세균 [화학유기영양성세균 (Chemoorganotroph)] 의 균주는 다음과 같이 관리한다.
 

 

환경에서 분리

 

타분양기관이나 연구소

선택적 배지와 조건에서 배양

 

└──────┬──────┘

 

순수 배양

농후배지 혹은 선택배지에서 순수분리하여 배양

 

동 정

FAME profile Analysis, ViTEK, 기타 생화학적 검사

 

보 관

-저온냉동보관

 


(가) 다양한 세균에 대한 선택적 배양

 

 

 

자연으로부터 다양한 생리학적 유형의 세균을 분리하기 위하여 선택적 배양(selective culture)기술이나 농후배양(enrichment culture)기술을 사용한다. 즉 특정한 종류의 미생물의 성장에 유리한 환경을 선택적으로 설정하는 원리를 이용하는 것이다. 그 방법에는 ① 탄소·질소 등의 영양분, pH, 산화·환원전위, 폭기정도, 삼투압, 표면장력, 그리고 기타 어떤 제한적 성분 첨가하는 등 배지 성분과 특성 조작, ② 온도와 빛의 변화 등을 통해 만들어진 이러한 요인들의 적정한 조절을 통해 자연계의 시료(토양, 폐수, 동·식물재)로부터 의도하는 종이나 생리학적 형태의 균을 분리할 수 있다.

 

 

 

(나) 순수배양의 분리

 

 

 

선택성 배지를 이용하여 원하는 세균이 우점적으로 자라면 세균을 다른 세균으로부터 완전히 순수 배양분리하여 생리, 생화학적 연구나 보존에 사용한다. 세균의 순수배양 분리는 크게 고체배지이용법과 액체배지상에서 분리의 두가지 방법이 있다. 대부분의 배양이 가능한 세균이 고체배지상에서 콜로니를 형성하므로 비교적 간편하게 순수분리를 이룰 수 있다. 방법은 멸균한 백금이를 미생물의 현탁액에 넣고 도말법으로 선을 그으면 집락들이 선을 따라 자라게 된다. 잘 분리된 집락을 선택하여 수회 반복하면 순수 배양세균을 분리할 수 있다.

 

 

 

(다) 배양세균의 보관

 

 

 

보존주의 보존 방법을 결정할 때에는 적당한 maintenance 배지, 이상적인 저장 온도, 이전의 빈도등 세 가지 조건을 고려해야 하며 대표균의 보존기간은 표 4.7.2와 같다.

 

 

 

1) 단기보관 : 계대배양 (subculture)

 

세균배양보존의 전통적인 방법은 정기적으로 신선한 배지에 옮기는 것이었다. 구체적 이전방법은 개체, 배지, 외부조건 등에 따라 다양하다. 이러한 연속적인 계대배양의 단점은 보관장소의 요구뿐만 아니라 오염, 균주번호의 오류, 또는 균주명의 오기, 변형체 또는 돌연변이체의 선택, 손실 등의 위험이 있어 장기보관에 적절하지 않다.

 

 

 

2) 중기보관

 

 

 

가) 저온 냉동(Deep Freezing)

 

 

 

-70℃에서 세균의 deep-freezing 보존은 보통 -20℃의 냉동기 보다 우수하다. deep-freezing 절차는 냉각 과정에서의 세포의 손상을 방지하기 위해 glycerol 또는 DMSO 같은 cryoprotective agent를 사용하여 세균을 냉동하는 과정을 포함한다. 많 은 세균들은 이 방법을 사용하면 몇 년 동안 성공적으로 보존된다.

 

 

 

나) 건조 (Drying)

 

 

 

대부분의 cultures는 실험 배지에서 건조된 상태로 놓아두면 죽지만 몇몇 포자를 형 성하는 배양주는 적당한 배지에서 건조된 상태로 몇 년 동안 보존될 수 있다. 세균 포자들은 건조를 포함해서 대부분의 보존 절차에서 살아남고 건조된 곳 그리고 토양 과 같은 더 축축한 배지에서 더 건조해진다면 저항성이 강해진다.

 

 

 

3) 장기보관

 

 

 

가) 동결건조 (Freeze-Drying, Lyophilization)

 

동결건조는 세균과 다른 미생물들을 장기간 보관하는 가장 경제적이고 효과적인 방법 중의 하나이다. 생리적으로 다양한 세균과 세균성 바이러스들이 이 기술에 의해 성공 적으로 보존되어 이것은 50년 이상 동안 생존도를 유지했다. 동결 건조는 감압하에서 승화시킴으로서 동결된 세균 suspension으로부터 수분을 제거하는 것을 말한다. 건조 된 세포들이 산소, 습기, 빛으로부터 보호된다면 오랜 기간동안 저장될 수 있고 언제 든지 다시 이전 상태로 회복될 수 있다.

 

 

 

나) 액체질소보존 (Ultrafreezing)

 

 

 

동결건조가 곤란한 세균 종의 장기간의 보존은 액체질소의 동결온도(-196℃)또는 액체 온도 (-150℃)에서 수행되어 왔다. ATCC는 표현형의 손실 없이 30년 이상 동안 액 체질소에서 많은 유해한 세균들을 성공적으로 보존해 왔다.

 

 

 

표 2. 대표적 세균속의 보관방법에 따른 보존기간
 

 

 

 

Genus

shelf life of bacteria preserved by:

Subculturing1

(월)

Immersing

in oil(년)

Deep freezing

(년)

Freez-drying

Ultra freezing/

 liquid nitrogen(년)

Acetobacter     1∼2      1           1∼3       >40       >40

Achromobacter    1        1∼2        1∼3       >40        >40

Acinetobacter    1주                             >40        >40

Actinobacillus   1주      2∼3                   >40        >40

Actinomyces      1        2∼3                   >40        >40

Agrobacterium   1∼2     1∼2                    >40        >40

Arthrobacter    1∼2     1∼2                    >40        >40

Bacillus       2∼12    12∼3                    >40        >40

Bacteroides       1주      1                     >40        >40

Bifidobacterium   1주                            >40        >40

Chromatium         1                             > 5        >40

Clostridium      6∼12   1∼2      2∼3          >40        >40

Corynebacteriu  m1∼2     1        1∼2          >40        >40

Enterobacter     1∼4    1∼2                    >40        >40

Erwinia          1∼4   1∼2                     >40        >40

Escherichia      1∼4   1∼2                     >40        >40

Flavobacterium    1      2                       >40        >40

Gluconobacter    1                               >40        >40

Haemophilus      1주  1월(37℃)                  >40        >40

Klebsiella       1∼4  1          1∼2           >40        >40

Lactobacillus     1주                            >40        >40

Methanobacterium2 1                              > 5        >40

Methanomonas2     1                              > 5         >40

Micromonospora   1                              >40         >40

Neisseria        1     1                        >40         >40

Nocardia      1∼4     1          1∼2          >30         >40

Proteus       1∼2     1          1∼2          >40         >40

Pseudomonas  1∼3                               >40         >40

Spirillum3    1주      1                         >40

Staphylococcus 1∼2                             >40        >40

Streptococcus  1∼2  1           1∼3           >40        >40

Streptomyces   1∼8   1∼2                      >40        >40

Xanthomonas                                     >40        >40

 

 

 

1 계대의 계획은 배지종류에 따라 정해진다. 시간은 대략적이며 종간의 변화가 속내에서 일어난다.

 

2 종에 의존한다. 3 Spirillum volutans.

 

 

 

(라) 동정

 

세균의 분류 및 동정은 생리적, 생태적 표현형과 유전형에 의하여 결정된다. 세균은 약 0.5u에서 수심 ㎛범위의 현미경적 크기로 매우 미세하고 형태상변이가 단순하므로 균주의 형태에 의한 표현형의 검사는 한계가 있다. 또한 영양분(탄수, 질소원 등)의 요구도, 효소생성능 등을 포함한 다양한 생화학적 검사를 필요로 하는데 분류군마다 열쇠가 되는 생화학적 검사의 종류가 크게 다르다. 분류에서 상시로 검사되는 생화학적 테스트의 목록은 표 3과 같다.

표 3. 상시 검사하는 표현형 검사목록
 

 

1. Acetamide Hydrolysls

2. Acid-Fast Reaction

3. Acidification of Carbohydrates

4. Agar Corrosion and Digestion

5. Ammonia from Arginine

6. Arginine Dihydrolase Activity

7. Aromatic Ring Cleavage

8. Arylsulfatase Activity

9. Bacitracin Sensitivity

10. Bile Solubility

11. Bile Tolerance

12. CAMP Test(β-Hemolysis

Accentuation)

13. Carbon Dioxide Requirement

14. Casein Hydrolysis

15. Catalase Activity

16. Cellulase Activity

17. Citrate Utilization

18. Coagulase Activity

19. Coccoid Bodies

20. Colonies

21. Cysts and Microcysts

22. Dye Tolerance

23. Esculin Hydrolysis

24. Esterase Activity

25. Flagella

26. Fluorescent Pigment

27. Formate-Fumarate Requirement

28. Gas Production from Sugars

29. Gelatin Hydrolysis

30. Glycosidase Activity

31. Gram Reaction

32. Hemolysis

33. Hippurate Hydrolysis

34. Hydrogen Sulfide Production from

Thiosulfate

35. Hydrogen Sulfide Production from

Cysteine

36. Indole Production

37. Indoxyl Acetate Hydrolysis

38. Iron-Porphyrin Compounds

 

39. 2-Ketogluconate from Glucose

Oxidation

40. 3-Ketolactose from Lactose Oxidation

41. Lactic Acid Optical Rotation

42. β-Lactamase Activity

43. Lecithinase Activity

44. Lipase Activity

45. Lysine Decarboxylase Activity

46. Lysozyme Resistance

47. Malonate Utilization

48. Meat Digestion by Anaerobes

49. Methyl Red Reaction

50. Milk Reactions

51. Motility, Swimming

52. Motility, Twitching

53. Nalidixic Acid Susceptibility

54. Nitrate Reduction and Denitrification

55. Nitrite Reduction

56. Nucleic Acid Hydrolysis

57. 0/129 Antibacterial Susceptibility

58. Optochin Susceptibility

59. Ornithine Decarboxylase Activity

60. Oxidase Activity

61. Oxidation/Fermentation Catabolism

62. Oxygen Relationships

63. Peptidase Activity

64. Phenylalanine Deaminase Activity

65. Phosphatase Activity

66. Poly-β-Hydroxybutyrate Presence

67. Poly-β-Hydroxybutyrate Hydrolysis

68. Proteinase Activity

69. Pyocyanin and Other Phenazine

Pigments

70. Pyrazinamidase Activity

71. Spores(Endospores)

72. Starch Hydrolysis

73. Triple-Sugar Iron Agar Reactions

74. Urease Activity

75. Voges-Proskauer Reaction

76. X and V Factor Requirements




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