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미생물이야기 방선균의 여러 분리에 대한 방법
2013-08-07 16:27:51
이엠생명과학연구원

방선균의 분리

 

(1) 시료의 채취와 수집방법

특정생태계로부터 대표적인 방선균 군 즉 특이한 환경영역에 존재하는 것을 분리하기 위해서는 시료채취에 특별한 주의가 요망된다. 시료는 될 수 있는데로 무균적으로 수집해야 하며 시료의 채집장소, 형태, 날짜 등을 기록해 두어야 한다. 토착적으로 존재하는 미생물군이 계절이나 기후의 영향으로 바뀔 수가 있기 때문에 주의하지 않으면 안된다. 시료가 실험실내에 들어오면 즉시 실험하거나, 4˚C에서 보관한다.

 

 

(2) 생태학적 인자와 배지

고려해야할 생태학적 인자는 온도와 pH, 이온강도, En력, 기질농도등이다. 이들 모든 인자는 야외나 실험실에서 측정된다. 방선균 분리배지는 시험해야 될 생태계나 서식지에 따라서 수정된다. 배양온도는 저온균을 분리하기 위해서는 4 - 15˚C 로 유지하고 고온균을 분리하기 위해서는 온도를 55 - 70˚C를 유지해야한다. 적은 양의 천연추출물을 최초의 분리를 위한 생육인자로 첨가한다.

방선균은 chitin과 같은 복합기질 뿐만 아니라 아주 낮은 농도로 존재하는 기질을 이용하는 능력이 효율적인 세균이므로 풍부한 생육배지 보다는 빈약한 배지를 많이 이용한다. 고온성균을 제외하고는 늦게 colony를 형성하여 4-20일간 배양한다. arginine-glycerol salt's ; Av, benedict, collodial chitin, GAC, M₃, staarch-casein 와 water agar가 대부분의 방선균 분리에 적합한 배지이다.

항진균물질인 nysatin과 cycloheximide가 곰팡이 생육을 억제하기 위하여 첨가된다. 분리한천배지는 세균의 생육을 최소화하기 위하여 3일동안 풍건한다.

 

(3) 토양으로부터의 방선균의 비선택적 분리

모든 진흙과 토양은 세균수를 줄이기 위해 3-10일간 멸균된 유리 petridish에서 풍건한다. 건조된 진흙과 토양은 멸균막자로 가루를 만들어 방선균 분리, 한천배지에 stamping한다. 작은 원통형 스폰지(15nm)로 말린 토양가루를 찍어 여분의 흙을 털어내고 9-12개의 다른 분리용 배지의 agar표면에 한 plate당 13개씩 연속적으로 찍어 접종하고, 분리하고자 하는 균의 온도특성에 따라 온도를 달리하며 높은 온도를 사용할 경우 배양후 분리한다.

높은 온도에서 agar plate가 마르는 것을 방지하기 위하여 물을 충분히 적신 여과지를 사용한다.

 

 

(4) 토양으로부터 방선균의 선택적분리

특이한 속의 생육을 좋게하거나 분리된 방선균의 총 수를 증가시키기 위하여 토양을 전처리 하는 방법이 많이 있다. 적당한 선택배지와 전처리의 조합이 특이한 속을 분리하기 위해서 필요하다.

 

(5) 식물체로부터 방선균의 분리

어던 생태계에서는 식물체로부터 분리된 방선균의 수에 있어서 계절적 변동이 있는 것으로 나타났다. 꽃체서 분리한 방선균은 줄기나 뿌리에서 분리한 방선균과는 다르다. 식물부위인 꽃, 잎, 윗줄기, 중간줄기, 아래줄기, 뿌리부분은 무균적으로 잘라, 멸균한 유리 petridish에서 건조한 후 agar 표면에 이식하거나 표면위에 굴려 도말한다. 또 다른 방법으로는 완충용액을 넣고 진탕하여 연속희석시켜 도말한다.

 

(6) 식물과 관련한 방선균분리를 위한 유인 기술

간단한 유인 기술이 식물로부터 방선균을 분리하기 위하여 사용될 수 있다.

 

 

(7) 물로부터 방선균의 분리

물시료의 전처리는 분리된 방선균의 수와 종류를 증가시킨다. 원심분리나 여과한 후 연속희석하여 평판하는 것이 수생 방선균을 분리하는데 유용하다. Rhodococcus와 Micromonospora는 55˚C에서 6분동안 silicone마개를 봉한 유리관을 가열함으로써 선택적으로 분리할 수 있다. 시료는 0.01% gelatin을 함유하는 Ringer 용액으로 희석한 후 M₃agar에 평판하여 30˚Cㅇ에서 배양한다.

Rhodococcus는 5-7일내에 나타나지만 Micromonospora는 10-15일이 걸린다. Actinoplane chitin agar, potassium tellurite를 첨가함으로써 의해 흐르는 물에서 분리할 수 있다. 




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