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미생물이야기 생물학적 질소·인 제거 프로세스에서 미생물의 생태와 기능에 대해 알아보자.
2013-08-07 16:50:01
이엠생명과학연구원

폐수프로세스 중에서 질소·인의 제거를 담당하는 세균과 해당 세균의 생태에 대해 분자생태학적 방법으로 확보한 자료에 대해 정리해 보았다. 질산화를 담당하는 세균은 극히 일부에 불과하지만 세균의 존재량과 활성 및 처리상황과의 관계에 대한 자료가 많이 수집되어 있다. 한편 탈질세균과 폴리인산 축적세균 및 다양한 미생물이 그러한 기능을 가지고 있으나, 프로세스와의 연관성을 아직 이끌어내지는 못하고 있다. 혐기성 암모니아 산화(ANAMMOX)의 경우는 반응을 담당하는 세균을 특정할 수 있는 단계에 이른 상태이다.

한편 최근 세균의 기질 섭취 상황을 동시에 검출할 수 있는 분자생태학적 방법이 등장하여 처리를 직접 담당하는 세균의 생태가 규명되고 있다. 그러나 이러한 세균을 둘러싼 다른 세균군의 역할을 가미한 평가는 이루어지고 있지 않기 때문에, 질소·인 제거 프로세스의 성능을 좌우하는 인자가 명확하게 드러난 상태는 아니다. 그러므로 향후 폐수처리 프로세스라는 커뮤니티(군집) 형성을 지배하는 규칙을 일반화하는 연구가 중요한 위치를 차지할 것으로 생각된다.

 

분자생태학적인 방법의 등장으로 인해 폐수처리 프로세스 중의 질소·인 제거에 관한 미생물의 생태에 대해 활발한 해석이 이루어지면서 중요한 자료가 다수 축적되고 있다. 한편으로는, 그 확보된 정보 또는 해석방법을 본질적인 의미에서 공학적으로 응용한 사례는 매우 적다고 할 수 있다.

이번 글에서는 우선 폐수처리 프로세스 가운데 생물학적 질소제거 프로세스에서의 질산화, 탈질, 혐기성 암모니아 산화(ANAMMOX)의 세 종류 반응(그림 1)을 담당하는 세균과 해당 세균의 생태에 대한 자료를 정리해 보았다. 이어서 생물학적 인 제거를 담당하는 세균 및 저해하는 세균과의 해당 생태에 대한 자료를 정리함과 동시에 공학적 응용을 지향하는데 있어서의 과제, 한계, 그리고 방향성에 대해 필자의 의견을 서술해 보기로 한다.

 

(그림 1) 생물학적 질소제거 프로세스에서의 질소순환

 

1. 질소제거 프로세스

 

1.1 질산화 프로세스

 

(1) 군집구조

 

암모니아성 질소를 질산성 또는 아질산성 질소(이후 각각을 암모니아, 질산, 아질산이라고 함)로 변환하는 질산화세균 군은 암모니아를 아질산으로 산화하는 암모니아 산화세균(AOB)과 아질산을 질산으로 산화하는 아질산 산화세균(NOB)의 두 가지 그룹으로 분류되며, 질산화세균군의 SSU(Small Subunit) rRNA 유전자에 근거한 계통연구가 정력적으로 이루어져 왔다. 최근에는 FISH((Fluorescence In Situ Hybridization)법 및 미소전극의 조합에 의해 바이오필름 등의 복합미생물 생태계에서 AOB 및 NOB의 공간분포와, 암모니아 산화활성 및 아질산 산화활성을 In Suit (원위치)에서 상세하게 해석하는 것이 가능해져 복합미생물 생태계에서 질산화세균 군의 생태가 밝혀지고 있다.

예를 들어, AOB에서는 고농도의 암모니아가 유입되는 폐수처리 프로세스에서는 Nitrosomonas속이 우점적으로 존재한다는 점이 일반적인 견해인데, Schramm은 바이오필터 내에서 Nitrosospira속의 암모니아에 대한 Km값은 Nitrosomonas속에 대해 비해 낮은 값임을 나타내었다. 즉, Nitrosospira속 또는 Nitrosomonas oligotropha와 같은 종류는 자연계와 저농도 암모니아가 유입되는 호기조에서 우점종을 이루는 경향을 보인다는 점이 밝혀졌다.

NOB의 경우에서는 지금까지 자연환경, 폐수처리 프로세스 모두 Nitrosobacter속이 대표적인 것으로 알려져 왔으나 호기조에서 Nitrosospira속이 우점적으로 존재한다는 사실이 밝혀졌다. 이는 Nitrosobacter속의 기질 친화성이 낮기 때문인 것으로 생각된다. vP수처리 프로세스에서 아질산농도는 낮은 수준으로 유지되는 경우가 많기 때문에 Nitrobacter속은 Nitrosospira속으로 도태되는 경향을 보이는 것으로 생각된다.

 

(2) 활성평가와 상호작용

 

SSU rRNA유전자에 근거한 계통연구의 발전과 동시에 실제기능을 담당하는 유전자(기능유전자군)에 관해서도 계통연구가 활발히 이루어지고 있다. AOB의 경우에서는 암모니아 산화효소유전자(amoA)가 바이오마커로서 유효하므로, amoA 유전자의 발현을 AOB 활성의 지표로 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 필자가 속한 그룹은 amoA의 mRNA 발현을 정량적으로 해석하고 기아상태에서의 활성회복기에 mRNA는 약 1∼2시간의 응답성을 나타내면서 증가한다는 사실을 밝힌 바 있다. 한편 DNA는 물론이고 rRNA의 경우에도 mRNA에서 관찰되는 것과 같은 급격한 증감 및 응답은 확인할 수 없었다. 이상과 같은 점에서 mRNA의 발현은 AOB의 활성을 매우 예민하게 반영하는 일면을 가지고 있는 것으로 생각된다.

 

1.2 탈질프로세스

 

(1) SSU rRNA유전자로 본 탈질세균의 군집구조

 

폐수 중의 질소제거는 질산화세균군의 대사에 의해 생성된 질산이 탈질세균의 순차적인 환원반응에서 탈질가스로 변환되면서 이루어진다(그림 1). 분자계통학의 진보와 함께 급속하게 발전한 SSU rRNA유전자(16S rRNA, 23S rRNA 등)에 근거하는 세균의 계통연구는 폐수처리 프로세스에 서식하는 탈질세균에도 응용되고 있다.

Neef가 속한 그룹에서는 단리주(單離株) 정보와 과거에 메탄올 자화능(資化能)이 밝혀진 탈질세균(Hyphomicrobium속, Paracoccus속)의 정보를 바탕으로 프로브를 선정하여 FISH 해석을 통해 메탄올 공여형 탈질 리액터 내의 세균군집 해석을 시도하고 있다. 그 결과 α- 및 β-Proteobacteria가 중요한 세균군집이라는 사실이 밝혀졌는데 메탄올 자화성 탈질세균으로 알려진 Hyphomicrobunm속과 Paracoccus속의 세균존재비는 각각 2% 및 4% 정도이다. 그러나 기타 이 시스템 내에 생식하는 대부분의 세균군집은 밝혀지지 않았다.

이에 Juretschko가 속한 그룹은 질산화·탈질프로세스의 활성슬러지에서 세균군집을 상세히 해석하고 Thauera속, Azoarcus속, Zoogloea속 등 β-Proteobacteria의 Rhodocyclales로 분류되는 세균군이 탈질반응을 담당한다고 밝힌 바 있다. 더욱이 Rhodocyclales에 속하는 세균의 rRNA를 표적으로 하는 올리고누클레오티드 DNA 마이크로어레이 개발에 착수하여 활성슬러지에서 Rhodocyclales의 세균군집 조성을 밝혀내고 있다.

그러나 암모니아산화 및 아질산산화가 일부 진정세균에 국한된 대사메커니즘인데 반해 질산 및 아질산호흡은 환경 중에 서식하는 진정세균, 고세균에 널리 분포되어 있으므로 SSU rRNA를 표적으로 하는 해석만으로는 시스템 내에 서식하는 탈질세균을 전체적으로 검출하거나, 실제 탈질 활성을 나타내는 세균을 특정하는 것이 곤란하다.

 

(2) 탈질효소 유전자군에서 본 세균군집 구조

 

최근 복합미생물 생태계에서 발생하는 탈질세균의 특이적 검출과 탈질 활성을 평가하는 방법으로 탈질효소 유전자군을 지표로 하는 해석이 시도되고 있다. 필자가 속해 있는 그룹이 높은 질소부하와 함께 많은 염기염류를 고농도로 함유하는 제련폐수의 질소제거를 담당하는 탈질세균군집을 아질산 환원효소 유전자에 의해 평가해보니, 혐기조의 유동조건(고정상, 유동상)에 따라 탈질세균의 다양성이 달라지는 것으로 밝혀졌다. 또 탈질세균의 존재량을 파악하기 위해 탈질효소 유전자를 표적으로 하는 정량 PCR이 이용되고 있다. 그러나 기능유전자를 표적으로 하는 PCR반응에 이용하는 축합중합 primer는 본래의 세균군집 구조를 왜곡할 가능성이 있는 등 문제점도 남아 있다.

 

(3) 기질대사활성으로 본 탈질세균의 군집구조

 

최근 몇 년간 급속하게 보급되어 온 해석방법인 안정 동위체와 방사성 동위체를 이용한 Stable-Isotope Probing(SIP)법 및 MicroAutoRadiography (MAR)-FISH법에 의해 탈질조건 하에서 고활성의 세균군을 특정하려는 시도가 이루어져 왔다. Ginige가 속한 그룹은 [13C]-메탄올을 탄소원으로 활성슬러지를 배양하고 SIP법에 의해 메탄올 자화성 탈질세균군을 측정하여 이러한 세균군을 특이적으로 검출하는 프로브를 이용한 MAR-FISH 해석에 의해 탈질조건 하에서 고활성의 메탄올 자화성 세균군을 가시화하고 있다. 또 Nielsen은 활성슬러지의 플록형성에 크게 관여하는 세균으로 β-Proteobacteria의 Aquaspirillum속을 특정함과 동시에 MAR-FISH 해석에 의해 Aquaspirillum속이 탈질반응에서도 중요한 세균이라는 사실을 밝히고 있다.

이와 같은 세균의 기능 및 활성에 근거한 해석방법의 도입에 의해 탈질세균뿐만 아니라 폐수처리 프로세스의 복합미생물 생태계에서 각종 세균에 대한 기능규명이 기대되는 바이다. 

 

1.3 혐기성 암모니아 산화프로세스

 

혐기성 암모니아산화(ANAMMOX) 반응을 담당하는 세균(ANAMMOX 세균)에 관한 정보가 1999년에 보고되면서 ANAMMOX 반응은 기존의 질산화·탈질 프로세스를 대신하여 신규질소제거 프로세스로서 최근 주목을 모으고 있다. 지금까지 ANAMMOX 세균은 Planctomycetes에 속하며 계통적으로 독립된 세균종으로는 Candidatus Brocadia속, Cand.Scalindia속, Cand. Kuenenia속의 세 종류가 보고되었다. 그러나 ANAMMOX 반응을 담당하는 세균으로서 새로운 종류에 속하는 세균도 보고되고 있어, 앞으로도 새로운 세균종이 발견된 가능성이 매우 높다.

ANAMMOX 세균의 생태에 관한 정보가 비약적으로 축적되고 있지만, 완전한 순수배양이 달성되고 있지 않은 상태이며, 또 절대 혐기성이고 더욱이 증식속도가 매우 낮은 것으로 알려 있으므로 ANAMMOX세균의 생태, 특히 생리학적 성질과 관련된 정보는 불충분하다고 할 수 있다. 그러나 이와 반대로 앞으로 새로운 내용이 속속 발견될 가능성도 매우 높다고 할 수 있다. Isaka는 종래 약 11일로 보고되어 오던 ANAMMOX 세균의 배가시간이 실제 환경 속에서는 2일 정도일 가능성을 제시하고 있다. 또 Fujii는 종속영양세균인 Zoogloea속이 ANAMMOX세균의 주위를 덮고 있다는 사실을 확인한 바 있으며, 어떤 상호작용이 존재할 가능성을 시사한 바 있다.

 

                                                              (그림 2) PAO 및 GAO의 생태모델

 

2. 인 제거 프로세스

 

생물학적 인 제거(EBPR) 프로세스의 기본구조는 혐기/호기 사이클로서 이러한 환경이 폴리인산축적세균(PAO)의 우점화를 촉진한다. PAO는 혐기조건 하에서 아세트산 등의 저급지방산을 섭취하여 PHA(폴리히드록시 알카노에이트)로서 세포 내에 축적한다. 이 에너지는 세포 내의 폴리인산(Poly-P)을 가수분해함으로써 얻어지며, 분해된 인산은 세포 외로 방출된다. 이어지는 호기조건 하에서 PAO는 축적된 PHA를 이용하여 증식하는 한편, 인산을 Poly-P로서 과잉 축적한다(그림 2A).

 

(1) SSU rRNA유전자에 착안한 PAO의 동정

 

분자생태학적 방법의 도입에 의해 지금까지 PAO로서 유력시되어 오던 Acinetobacter속이 EBPR에서 몇 %밖에 존재하지 않는다는 사실이 확인되었다. 또 아세트산을 주요 탄소원으로 하는 회분식 활성슬러지 조(이후 SBR이라고 함)에서는 인 제거 능력이 양호할 때 Rhodocyclus속에 근접한 세균(RPAO)이 우점종이 되는 것으로 밝혀졌다.

Hesselmann은 광합성세균인 Rhodocyclus속 단리주가 암소에서 생육하지 않고 RPAO와는 생태가 다르므로 새로운 속에 새로운 종인 Cand. Acc-umulibacter phosphatis라고 제안하고 있다. 또 Crocetti는 PRAO를 검출하는 프로브(PAO462, PAO651, PAO846)를 이용하여 FISH법을 통해 해석함으로써 슬러지 내의 인 함유율 및 RPAO의 개체수 밀도와 높은 상관관계가 있다는 사실을 나타내고, RPAO가 EBPR에서 중요한 역할을 담당하는 미생물이라는 사실을 나타냈다. 한편 Liu는 RPAO와 함께 Actinobacteria에 속하는 PAO(APAO)가 EBPR에서 우점적으로 존재한다는 사실을 보고한 바 있다.

 

(2) 기능유전자에 착안한 PAO의 동정(확인)

 

탈질세균과 마찬가지로 PAO의 기능유전자에 착안한 해석이 이루어지고 있다. Michinaka는 PHA 합성유전자(phaC)에 착안하여 실제의 폐수처리장에서 검출된 phaC 유전자가 단리주와는 계통학적으로 다르다는 점을 보고하고, phaC 유전자가 EBPR 프로세스의 모델화에 관한 새로운 지표로 될 수 있는 가능성을 시사한 바 있다. 또 질산·아질산을 전자수용체로 이용하여 Poly-P를 축적하는 탈질성 인축적세균(DNPAO)를 대상으로 nirS, nirK 유전자에 착안한 해석도 이루어지고 있다.

Shoji는 실제 폐수유입 SBR의 혐기/호기 사이클에서 혐기/무산소/호기, 혐기무산소(질산), 혐기/무산소(아질산) 사이클로 변동시켜 16S rRNA 유전자 및 nirS 유전자에 근거한 군집구조 패턴을 평가한 결과, 각 유전자에 근거한 군집패턴이 사이클별로 각각 다른 거동을 보이는 것으로 보고되었다. 필자가 속한 그룹은 호기 SBR(항상 질산이 잔존하는 조건)에서 RPAO를 비롯하여 Rhodocyclales에 속한 Thauera속, Azoarcus속의 nirS 유전자 배열에 근접한 배열을 가진 DNPAO가 존재한다고 보고한 바 있다. 여기서 매우 흥미로운 점은 Shoji가 보고한 혐기/무산소/호기 사이클 시에 출현한 nirS 유전자 배열과 필자가 속한 그룹이 검출한 배열이 모두 Azoarcus tolulyticus에 근접한다는 사실이다. 따라서 산소·질소 모두 이용 가능한 DNPAO가 이러한 유전자 배열을 가지고 있을 가능성이 높다고 생각된다.

이러한 기능유전자에 착안한 연구는 PAO만을 망라하여 검출하는 방법이 아니다. DAPI 염색에 의한 PAO의 검출 및 정량은 가능하지만 혐기조건 하에서도 PolyP-Positive한 세균이 존재하고 있으며, 실제로 호기조건 하에서 섭취되고 있는 인을 검출하기 위해서는 나중에 설명하는 MAR-FISH법을 이용해야 한다. McMahon은 RPAO의 Poly-P 합성유전자(ppk) 배열을 특정하여 mRNA를 검출하고 있는데, 현재로서는 EBPR에서의 ppk 유전자 검출 및 정량을 실시하고 있다는 보고가 발표된 적이 없으므로 PAO의 종합적인 검출 및 정량방법 개발이 향후 과제라고 할 수 있다.

 

(3) 기질대사 활성으로 본 PAO의 생태 규명

 

MAR-FISH법에 의한 생태해석이 EBPR에 존재하는 세균에 대해서도 이루어지고 있다. Kong은 RPAO 및 APAO의 생태를 평가한 결과, 혐기조건 하에서 아세트산만으로 배양한 경우는 어떤 전자수용체(산소·질산·아질산)에서도 RPAO만이 인(P-33)을 섭취하는데, 실제 폐수를 이용한 경우에는 RPAO 및 APAO 모두 아질산 존재 하에서 인을 섭취하지 않는 것으로 보고되었다. 또 APAO는 종래의 생태모델과 달리 혐기조건 하에서 아세트산을 섭취하지 않고 아미노산 등을 섭취하며 PHA를 축적하지 않는다는 사실을 시사한 바 있다.

 

(4) EBPR에 기인한 원인불명의 처리성능 악화

 

연구실 규모의 리액터에서 실제 폐수처리 프로세스에 이르기까지 인 제거 능력이 급격하게 악화하는 경우가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상이 발생하는 메커니즘에 대해서는 많은 연구가 이루어지고 있으나 아직 규명되지는 않고 있다. 단, 처리성능이 악화된 경우에는 글리코겐 축적세포(GAO), 형태에 따라서는 G-Bacteria라고 불리는 미생물군이 우점화하는 것으로 보고된 바 있다. GAO는 PAO와 마찬가지로 혐기조건 하에서 유기물을 자화(資化)하여 PHA를 생성하는데, 호기조건 하에서는 Poly-P를 축적하지 않으므로 혐기조건 하에서 PAO와 유기물 획득경쟁을 하는 것으로 추정된다(그림 2B). Crocetti는 인 제거 능력이 악화된 아세트산유입 SBR에서 γ-Proteobacteria에 속한 세균이 우점화한다는 사실을 확인하고, 본 세균을 Cand. Competibacter phophatis(GAO)로서 제안한 바 있다.

Cech는 인 제거 능력이 악화된 아세트산·글루코스 유입 SBR에 분자상의 군체를 만드는 구균(G-bacteria)이 우점화한다고 보고하였다. Maszenan은 α-Proteobacteria인 Amaricoccus속 및 Defluvicoccus vanus를 G-Bacteria로서 단독 분리하고 있다. 그러나 Amaricoccus속은 혐기조건 하에서 아세트산, 글루코스를 자화시키지 않고 호기조건 하에서만 PHA를 생성하므로 GAO가 아닌 것으로 추정된다. 또 D. vanus는 호기조건 하에서 아세트산, 프로피온산, 글루코스를 자화하고 PHA만을 하는 것으로 보고된 바 있다.

인 제거 능력이 악화된 EBPR에 우점화하는 α-Proteobacteria에 속하는 G-Bacteria를 검출하는 프로브가 Beer, Wong에 의해 설계되어 GAO로서 보고된 바 있다. 또 필자도 인 제거 능력이 양호할 때 α-Proteobacteria에 속하는 G-bacteria가 우점화하고 혐기조건 하에서 아세트산을 자화하며 Poly-P를 축적하지 않는다고 보고한 바 있다. 더욱이 Beer와 Wong이 설계한 프로브에서는 이러한 G-Bacteria가 검출되지 않는다고 보고되고 있는데, α-Proteobacteria에 속한 G-Bacteria의 경우 형태는 동일하지만 계통학적·생태학적인 면은 다양한 것으로 추정된다.

한편 G-Bacteria로서 Poly-P 축적 능력을 가진 세균(Tessaracoccus bendigoensis, Tetrasphaera속, Quadricoccus australiensis, Lampropedia hyalina, Quadrisphaera granulorum) 등도 보고된 바 있다.

이상과 같이 복합미생물 생태계에서의 생태해석이 활발히 이루어져 EBPR 프로세스에서 중요한 역할을 담당하는 미생물(PAO·GAO)의 생태가 서서히 밝혀지고 있다. 그러나 운전조건·운전방식과 PAO·GAO의 존재량에 관한 통일된 모델이 없는 것이 현실이다. 그러한 원인은 기존의 연구가 PAO·GAO에만 착안한 연구이기 때문으로 생각된다. 당연히 PAO·GAO의 특정 혹은 단독 분리를 위한 노력이 중요한데, EBPR 프로세스에는 원생동물을 비롯해 인 제거 능력에 간접적으로 영향을 미치는 세균군이 존재하기 때문에, 이러한 세균과 PAO·GAO의 관계에 착안한 연구가 더욱 중요할 것으로 생각된다.

한편으로 복합미생물 생태계 안에 존재하는 전체 유전자 정보를 망라하여 해석하는 메타게놈 해석이 EBPR 프로세스에도 도입되고 있어, EBPR 프로세스 안에서의 미생물간 경합·공생 관계 등이 유전자 차원에서 밝혀지려고 하고 있다. 앞으로는 그러한 미생물간 상호작용에 관한 연구가 다수 이루어져 EBPR 프로세스의 메커니즘이 더욱 명확하게 해석될 것으로 기대되는 바이다.




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