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미생물이야기 미생물의 보존법에 대하여...
2013-08-08 17:13:30
이엠생명과학연구원

1. 단기보존법

 

(1) 계대배양(subculturing)

신선한 배지에 방선균을 주기적으로 옮겨주는 전통적인 방법으로 이식주기는 방선균이 종류, 배지 종류, 외부 환경에 따라 다르다. 이 방법을 이용할 경우 세 가지 조건을 검토, 결정해야 한다. 첫째 적당한 보존용 배지, 둘째 이상적인 보존 온도, 셋째 옮겨주는 주기빈도이다.

보존용 배지(maintenance medium); 미생물의 대사율을 낮게 유지시킴으로서 이식 빈도를 줄이는 데는 최소배지(minimal media)를 사용하는 것이 좋으나 경우에 따라서는 복합배지(complex)를 사용하여 특정한 생리적 특성을 유지하기도 한다. 이때는 증식이 가속되고 대사산물 축적이 빨리 일어나므로 배지를 자주 갈아주어야 한다.

보관(storage); 간단히 상온에서 시험관대에 보존하기도 한다. 건조의 위험을 최소화하기 위해 고무띠가 있는 마개나 파라필름을 사용하거나 시험관을 플라스틱 통에 넣어두어야 한다. 대사속도를 줄이기 위해 냉장고(5~8℃)에 보관하면 3~5개월 보존이 가능하다.

계대배양 방식(transfer schedule); 배지를 갈아주는 시간 간격은 실험에 의해 결정되는데 연속적으로 배지를 갈아주면서 균주가 순수배양 되는지 검사하고 형질이 변화되는지 간략한 특성판별(characterization)이 수행되어야 한다.

이 균주 보존법의 단점은 오염의 위험, 잘못된 표기의 가능성, 돌연변이주의 선별가능성, 균주의 손실 가능성, 그리고 필요한 보관 장소를 들 수 있다.

 

(2)광유(mineral oil) 침지보존법

멸균된 광유(액체파라핀 등)에 담그는 간단하고 저렴한 방법으로 몇 달 내지 몇 년 동안 보관할 수 있다. 오염을 방지하기 위하여 광유는 170℃ 오븐에서 약 1~2시간 가열 살균한다(고압증기 멸균은 부적합). 사면배지에 배양한 후 멸균된 광유를 적어도 2cm이상 넣고 냉장고에 바로 세워 보관한다.

 

(3)동결보존법(freezing)

냉장고의 냉동실이나 -5~-20℃ 범위의 냉동고에서 균주를 보존한다. 사면배양이나 액체배양을 한 후 균사체를 분주하여 얼려서 보존하는 것인데 약 6개월 2년간 보존이 가능하다. 다만 용융(eutectic) 온도에서는 세포가 손상을 입기 때문에 -20℃인 전해질 용액(NaCl용액 등)이 함유된 경우에는 부적합하다.

 

(4)건조 보존법(drying)

포자 형성 방선균을 토양이나 silica gel에서 건조시켜 보존할 수 있으며, 유리 구슬(자기 bead) 같은 불활성 고형무질 표면 위에 포자를 건조 시켜 보존할 수 있다. 토양이나 silica gel은 씻어서 screwcap시험관에 분주하여 고압멸균한 후 25℃에서 건조시킨다.

토양보존법; 멸균 건조된 토양 5g을 넣고 거즈를 둘러싼 면전으로 마개를 시험관에 균주의 conidia현탁액 1㎖를 넣는다. 접종된 토양 시험관을 25℃에서 천천히 건조시켜 충분히 마르면 고무마개로 밀봉한 후 냉장고에 보존한다. 활성화시킬 때는 토양 일부를 무균적으로 취하여 새로운 사면배지에 뿌리면 된다.

Silica gel 보존법; 멸균된 silica gel을 시험관에 반쯤 채운다. 사면배양에 10%skim milk용액 1~2㎖을 첨가하여 포자현탁액을 만든다. 포자현탁액 0.5㎖을 silica gel 시험관에 방울방울 첨가한다. 골고루 묻히기 위하여 시험관을 교반한다. 25℃에서 건조한 후에 오산화인 같은 건조제가 존재하는 밀페된 용기에 저장한다.

자기(porcelain) bead 보존법; 10~12개의 자기 bead를 screw cap한 유리 vial에 넣는다. 121℃에서 15분간 vial을 살균한다. 사면배양한 시험관에 20% sucrose 용액 1~2㎖를 첨가하고 피펫으로 긁어서 포자현탁액을 만든다. bead를 멸균된 plate에 꺼내 놓고 각 bead에 포자 현탁액 1방울씩을 접종한다. 다시 forcep으로 접종한 bead를 10~12씩 vial에 옮겨 넣는다. 각 vial을 진공 desicator에 넣고 72~92시간 동안 진공하에서 건조한다. 건조가 끝나면 무균 spatula로 bead를 부순 후에 건조제가 든, 25℃, 밀봉된 건조기에서 보존한다.

단기 보존법에는 이외에도 종이(paper) 보존법, 젤라틴(gelatin)보존법 등이 있다.

 

2. 장기보존법

 

(1)동결건조법(lyophilization)

미생물을 오랫동안 보관하는 가장 경제적이고 효과적인 방법 중의 하나로서 이 방법은 생리적으로 다양한 많은 미생물과 bacteriophage를 30년이상 보존할 수 있다. 또 이 방법은 용기가 작아 보관하기가 유리하다.

감압하에서 얼린 미생물 배양액으로부터 승화에 의해 물을 제거하는 동결건조법은 매우 간단하지만 이론적인 배경은 복잡하다. 이 방법에 의해서 건조된 미생물은 산소, 습기, 빛에 노출되지 않으면 오랜 기간 보존할 수 있으며 필요할 경우 본래의 상태로 되돌릴 수 있다.

장치; freeze-dryer는 동결조(cold bath), 냉각기(compressor), trap, 고진공펌프, 다기관 등으로 구성되어 있다.

용기; 크기와 모양은 다양하지만 기본적으로 이중의 연질유지가 사용된다. 사용 전에 반드시 살균하여 사용하고, 외부용기에는 푸른 실리카겔을 넣어 함습의 표지로 사용한다.

배양액의 조제; 액체배양에서는 대수증식기의 균사체, 고체배양에서는 포자를 포집하여 현탁액을 만든다. 분산매(동결방지제, cryoprotective agent) 1~2㎖를 사면배지에 첨가하여 loop로 긁어서 현탁액을 만들거나, 액체 배양인 경우에는 원심분리한 후 분산매를 첨가하여 현탁하거나, 여과한 모은 균사체를 분산매에 현탁하거나 한다.

동결방지제; 동결방지제는 현탁시 분산매, 동결시와 동결후 건조시 완충작용 및 보호작용을 위하여 매우 중요하다. 분산매는 균종과 연구소에 따라 독특한 조성을 사용하지만 주로 많이 사용하는 것을 보면 다음과 같다. 다음 조성의 농도는 최종 농도이다.

 

skim milk 10%, skim milk 5% + glucose 5%, sucrose 12%, dextran 10%, starch 20%, Inositol 10%, trehalose 10% Monosodium glutamate(MSG) 3% + 0.1M phosphate buffer(pH7.0)

MSG 3% + ribitol1.5% + cysteine.HCl 0.05% + 0.1M phosphate buffer(pH7.0)

 

위의 동결보호제 멸균시에는 caramelization이 일어나지 않도록 5㎖씩 시험관에 분주한 후 116℃에서 20분간, 2회에 걸쳐 간헐멸균한다.

동결건조작업; 균사체 또는 포자 현탁액을 동결건조용 앰플에 0.1~0.2㎖씩을 입구에 묻지 않도록 조심스럽게 분주한다. 앰플 입구를 면전한다. 동결건조기에 부착된 예비동결조에서 예비 동결을 하거나 없으면, 드라이아이스+에탄올 bath를 이용하거나 deep freezer를 이용한다. 동결이 완전히 일어나면 재빨리 앰플을 동결건조기에 걸어서 고진공을 만든다. 온도가 높은 하절기나 진공도가 낮을 경우에는 시료가 녹아서 끓어오르는 경우가 있는데 이때는 실패이다. 이러한 경우를 방지하기 위하여 동결건조 초기에는 열이 차단되도록 앰플을 감사주거나 이중 용기안 진공이 된 곳에 넣거나 하고 1일이 지난 후 제거한다. 동결건조의 완료는 실온과 시료의 온도가 같은 시점이므로 만져서 차갑게 느껴지지 않으면 완료된 것이다. 일반적으로 사용되는 동결건조기의 예를 그림 1에 나타내었다.

 

(2)초저온 냉동보존법(ultra-freezing)

장기보존을 위해서는 동결되어 -50~-80℃범위에서 보존되어야 한다. 이러한 온도 범위의 보존은 초저온 냉동기(-80℃), 액체질소(-196℃), 액체질소증기(-150℃)에서 얼린 상태로 보존할 수 있다(16, 21, 22). 15년간 보존도 가능하다고 보고되고 있는데 초저온 냉동고의 경우는 고장이나 정전에 주의 해야하고, 액체질소의 경우 유지비가 많이 드는 단점이 있다. 일반적인 보존 기간은 -60℃에서 5년간으로 보고되고 있다(16, 21).

동결보존제(cryoprotective agent); 글리세롤(glycerol)과 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)는 세포막을 쉽게 통과하여 세포 내부와 외부가 빙점 이하로 떨어지는 것을 방지하는 보존제이다. 설탕, 유당, 포도당, 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 덱스트란(dextran), 폴리글리콜(polyglycol) 같은 동결보호제는 세포막 밖에서 동결을 방지한다. 대체로 전자의 냉동방지제가 효과적이며 글리세롤과 DMSO가 널리 사용되고 있다. 물론 사용 전에 내성시험(tolerance test)을 거쳐야 되지만 글리세롤은 10%, DMSO는 5%가 최적 농도이다. 글리세롤은 고압살균(autoclaving)으로, DMSO는 막 여과기(membrane filter)로 멸균하며 5℃에서 얼린 상태로 보존한다(DMSO의 빙점은 18℃)(22).

배양액 준비; 대수증식기 후기의 균사체를 사용한다. 사면배양의 경우 10% glycerol가 포함된 nutrient broth 10㎖를 사면시험관에 넣고 포자와 균사체를 긁어낸다. 세포현탁액을 2㎖씩 동결용 vial에 분주하고 냉장고에서 30분간 방치하여 균사체와 현탁액간의 평형이 이루어지도록 한다.

액체배양액은 동량의 20% glycerol 또는 10% DMSO를 동량 첨가한 잘 혼합한다. 세포현탁액을 2㎖씩 동결용 vial에 분주하고 냉장고에서 30분간 방치하여 균사체와 현탁액간의 평형이 이루어지도록 한다.

동결시 냉각 원칙; 동결시 냉각속도(cooling rate)는 미생물의 생존에 중요한 요소로 작용하는데 일반적으로 느린 냉각속도(1~2℃/min)가 냉동보존법에 적당하다.

해동 원칙; 동결된 균주를 녹이기 위해서는 ampoule을 37~40℃의 water bath에 넣고 가볍게 흔들어 녹인다. 유리 앰플의 경우 약 40~60초가 소요된다. 다녹으면 꺼내어 표면을 70% 에탄올로 소독한 후 개봉하여 사용한다.




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