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미생물이야기 동물바이러스 시험법 (assay of animal viruses)
2013-08-08 17:30:25
이엠생명과학연구원

동물바이러스 시험법 (assay of animal viruses)

 

1) 바이러스의 분리 및 정제 (purification of viruses)

     증식된 바이러스에 대하여 조사하기 위해서는 바이러스를 분리하거나 그 구성 요소들을 분리할 수 있어야한다.  바이러스는 그 자체가 단백질과 핵산으로 되어 있고 매우 균질하여 단백질과 핵산을 다루는 일반적인 생화학적인 기술들을 이용하여 손쉽게 다룰 수 있다.    

 

 

 a) 바이러스의 분리법

     여과법 (filtration)은 바이러스보다 분자량이 큰 생명체 특히 세균들로부터 바이러스를 구분해낼 때 많이 이용한다.  증식하여 배지 중으로 방출된 바이러스는 분자량이 작기 때문에 숙주세포처럼 가라앉지 않고 수용액처럼 존재하게 된다.  그러므로 바이러스가 포함된 용액으로부터 바이러스를 분리할 때 이 방법을 사용할 수 있다.  특히 시료에서 세균과 바이러스를 분리하고자 할 때 세균여과기를 이용하는 방법이 바로 여과법이다.  

     salting out 방법은 수용액으로 녹아있는 단백질과 같은 거대분자화합물 (macromolecules)을 가라앉힐 때 사용하는 방법으로 바이러스를 가라앉힐 때에도 사용할 수 있다.  바이러스가 들어있는 용액에 적당한 염류 (salt)를 첨가하면 바이러스와 물분자사이의 결합력에 변화가 생기게되고, 결과적으로 바이러스들이 서로 모여 침전을 형성할 수 있다.  침전이 형성되면 원심분리하여 바이러스를 모을 수 있는 것이다.

     원심분리법 (differential centrifugation)은 위의 두 방법보다 순수하게 바이러스를 분리할 수 있는 방법으로, 용액에 녹아있는 바이러스를 강한 원심력으로 가라앉혀서 용액으로부터 분리해내는 방법이다.  바이러스는 그 분자량이 작기 때문에 세균의 침전에 사용하였던 일반적인 원심분리법을 사용하지 못하고, 원심력이 매우 높은 초원심분리 (ultracentrifugation)를 사용하여야 한다.  또한 바이러스 용액을 밀도의 구배 (density gradient)가 형성되는 적당한 매질에 녹여서 원심분리하게되면, 바이러스들은 자신과 밀도가 같은 지역에 서로 모여서 띄 (band) 모양을 이루게되며, 이 띄를 모으면 순수한 바이러스를 정제할 수 있다.

 

 

 

 

 

 

 b) 동물 바이러스 구성 성분의 분리 및 정제

      바이러스의 핵산이나 단백질을 분리하기 위해서는 우선 위에 언급한 방법으로 바이러스 용액을 정제한 다음, 그 안에 존재하는 단백질이나 핵산을 분리해내는 방법을 이용하면 된다.  예를 들어 단백질을 모으고 싶으면 핵산을 분해해버리면 되고, 핵산을 모으고 싶으면 단백질을 분해해 버리면된다. 동물바이러스의 단백질을 조사하는 데에는 단백질 종류의 분석, 분자량측정 등 여러 가지 생화학적인 방법이 이용되며, 특히 면역학적 방법들도 많이 이용된다.  바이러스 단백질에 대한 항체를 준비한 다음, 이 항체를 이용하여 특정한 단백질의 존재 확인 (western blotting, ELISA, Immunofluorescence)이나 분리에 이용할 수 있다.  바이러스 핵산에 대한 분석은 바이러스를 정제한 다음, 단백질을 제거하고 나서 남아있는 용액을 이용하면 된다.  바이러스 핵산 분석으로는 바이러스 genome의 종류, 모양, 크기, genome 지도 작성, 더 나아가 염기배열 등을 밝힐 수 있다.  

 

 

 

2) 바이러스 감염 단위의 분석법 (infective unit)

      바이러스의 감염 단위라는 말은 다른 말로 살아있는 바이러스 하나를 말한다.  바이러스 입자의 수가 전자현미경으로 확인 한 결과 100개라 하더라도 이들 100개가 모두 다 감염되어 새로운 바이러스를 증식해내지는 못하는 경우가 많다.  그러므로, 바이러스의 정확안 숫자는 살아서 증식하여 새끼를 만들 수 있는 바이러스의 수를 말하는 것이 되며, 이 숫자를 감염단위 수하고 부른다.  바이러스의 감염단위를 조사하기 위하여는 바이러스의 존재를 생물학적으로 확인하여야 한다.  

 

 

 a) 프라그 시험법 (plaque assay)

     plaque는 일반적으로 병적인 변화로 발생한 손상을 말한다.  바이러스의 경우는 바이러스의 감염에 의하여 손상된 숙주세포가 주위의 정상적인 세포와 구별되게 나타나게 되는 데, 이러한 손상된 세포의 집단을 프라그라고 부른다.  프라그를 형성하기 위해서는 먼저 숙주 세포를 단층으로 (monolayer) 배양한 후, 이들 세포에 virus를 감염시킨다.  여기에, 한천이 첨가된 배지 (soft agar medium)를 부어 세포와 바이러스를 굳힌다.  이렇게 하면 증식된 바이러스가 배지 용액을 따라 섞이지 않고, 감염된 세포와 그 근처에만 존재하게된다.  그 후, 감염된 세포가 죽거나 변하여 나타나는 plaque의 수를 세게되면, 바이러스 용액에 들어 있는 감염단위의 수를 측정할 수 있다.

     plaque는 바이러스 감염 결과 세포에 발생한 손상을 말하는 것으로 종종 맨눈이나 광학현미경으로 관찰할 수 있다.  가장 손쉬운 방법으로 프라그를 확인하는 방법은 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하여 염색되는 염색약을 사용하는 방법이다 (염색법, dye staining, 그림 6).  예를 들어 neutral red는 살아있는 세포를 붉게 염색하고 바이러스에 의하여 죽은 세포는 염색하지 못하므로, 프라그가 붉은 배경에 나타날  것이다.  일부의 바이러스는 envelope에 hemmaglutinin (혈구응집원, HA) 이라는 적혈구응집작용이 있는 단백질을 가지고 있으며, 감염된 세포의 표면에 이 HA 단백질을 발현한다.  이 HA 단백질을 발현하고 있는 숙주세포에 적혈구를 넣어주면 적혈구가 세포 표면에 달라붙어서 붉은 색의 프라그가 형성되는 것을 볼 수 있다 (혈구흡착법, hemadsorption).  그 외에 세포융합 (cell fusion)을 촉진하는 바이러스를 분석할 때에는 바이러스 감염결과 형성되는 합포체의 형성을 조사하면 된다 (syncytia formation).  이러한 바이러스에 감염된 세포들은 하나의 커다란 세포처럼 보이게 되며, 결과적으로 핵이 여러 개 있고 세포질이 커다란 프라그를 형성한다.  

    바이러스의 감염 결과 위에서 언급한 것과 같은 프라그를 형성하지 못한다면, 바이러스의 표면 단백질에 대한 항체를 이용한 면역형광법 (immunofluorescence)을 이용하여 프라그를 확인할 수도 있다.  바이러스에 감염된 세포는 바이러스의 항원을 세포 표면에 발현하게되므로, 이 바이러스 항원에 대한 항체를 이용하여 바이러스 항원을 발현하는 세포의 프라그를 확인할 수 있다.  바이러스에 대한 항체에 형광물질을 결합시켜 바이러스에 감염된 세포와 반응시킨 다음, 형광현미경 (fluorescence microacopy)로 관찰하면 형광을 뜬 프라그를 확인할 수 있다. 

 

 b) 포크형성 시험법 (pock assay)

     포크는 바이러스 감염에 의하여 수정란의 막에 생긴 프라그를 말한다.  이 방법은 바이러스를 chick embryo membrane에 감염시킨 후, 수정란 막에 형성된 포크의 수를 세는 방법이다.

 

 

 

 

 c) 초점형성시헙법 (focus forming assay)

     이 방법은 감염되면 숙주세포에 형질전환을 쉽게 유도하는 바이러스를 분석할 때 이용된다.  즉, 발암바이러스에 감염된 세포는 형질전환되어 단층의 정상세포 사이에 다층의 형질전환된 세포덩어리 (형질전환의 초점)가 나타나게 되는 데, 이 다층의 세포 덩어리를 세어 봄으로서 형질전환을 유도하는 바이러스의 수를 셀 수 있는 것이다.  

 

 

 

3) 물리화학적인 방법 (chemical and physical methods)

 

 a) 전자현미경을 이용하는 방법 (electron microscopy)

     전자현미경은 그 해상도1nm 정도이므로 일반적으로 10nm 이상인 바이러스의 입자를 볼 수 있다.  이 방법으로는 바이러스 입자의 수나 입자의 모양을 측정할 수 있다.   

 

 b) 초원심분리법 (ultracentrifugation)  

     밀도의 층 (density gradient)을 이용하여 매질의 밀도와 같은 밀도를 가진 바이러스 입자를 분리하는 방법이다.

 

 c) 전기영동법 (electrophoresis)

     바이러스의 단백질 (protein) 이나 핵산 (nucleic acid)을 분석할 때 이용하는 방법으로, acrylamideagarose와 같은 겔상태의 물질을 이용하여 단백질이나 핵산을 그 크기에 따라 구분할 수 있는 방법이다.  

 

 

 d) 면역학적 방법 (immunological methods)

     면역학적인 방법으로 바이러스를 조사하는 방법은 항원-항체 반응을 이용하는 시험법들이며, 혈청학에서 이용하는 각종의 방법들이 이용된다.

     중화항체법 (neutralization test)은 바이러스의 감염성을 항체가 없애주는 것을 이용하는 방법으로, 먼저 바이러스를 항체와 반응시킨 후, 바이러스와 반응한 항체 때문에 바이러스가 숙주세포에 감염되지 못하여 증식하지 못하는 정도를 측정한다.
      혈구응집 방해법 (hemmagglutination inhibition, HI)은 혈구응집원이라는 적혈구 응집기능이 있는 단백질 (HA protein)을 생산하는 바이러스를 분석할 때 이용된다.  혈구 응집능력이 있는 바이러스는 적혈구를 서로 연결하여 커다란 적혈구 응집체를 형성한다.  이러한 성질이 있는 바이러스에 혈구응집원에 대한 항체를 반응시키면, 바이러스가 혈구응집원을 이용하여 적혈구를 응집할 수 없게 된다
     보체고정법 (complement faxation, CF)은 항원과 항체가 결합된 항원-항체 복합체가 혈액에 존재하는 보체를 활성화시키는 성질을 이용한 방법이다.  즉, 바이러스를 항체와 반응시킨 후, 바이러스와 결합된 항체가 혈액의 보체를 활성화시켜 혈액의 보체가 사라지는 것을 측정한다.  
     면역침전법 (immuno-precipitation reaction)은 바이러스 항원과 항체를 반응시켜 생성되는 침전을 분석하는 방법으로 주로 특정한 바이러스 항원을 분리할 때 이용한다.  
      면역형광법 (Immunofluorescence)은 항체에 형광물질을 결합시켜, 바이러스에 감염된 세포나 조직과 반응시켜 봄으로서 바이러스의 존재여부를 조사할 때 많이 이용한다.  
      효소면역시험법 (enzyme linked immuno-sorbent assay, ELISA)은 효소가 결합된 항체를 이용하여 이 항체와 반응하는 항원의 양을 조사할 때 이용하는 방법으로, 현재 많은 종류의 바이러스 감염증 진단에 이용되고 있다.

 

 

e) 방사능 동위 원소를 이용하는 방법 (radiochemicals)

     이 방법은 방사능 동위원소 (radio-isotope)를 이용하여 바이러스의 단백질이나 핵산을 표지하고, 이들 단백질이나 핵산이 어떻게 되는 지를 조사할 때 이용한다.   32P는 핵산을 표지할 때 사용하며, 35S는 단백질을 표지할 때 이용한다.

 

 

 f) 바이러스의 효소를 이용한 방법

     바이러스가 가지고 있는 효소의 양을 측정함으로서 바이러스의 증식정도를 상대적으로 측정할 수 있다.  이 경우 조사대상이 되는 효소는 바이러스에만 있어야 하며 숙주세포의 효소 때문에 오 반응이 나타나서는 안된다.  이러한 방법으로 사용되는 대표적인 효소에는 레트로바이러스 증식을 조사하는 데 이용되는 역전사효소 (reverse transcriptase)의 분석법을 들 수 있다.

 

 

 g) 분자생물학적 방법 (molecular biological technique)

     분자생물학적인 방법은 최근에 바이러스의 분석법으로 많이 이용되고 있는 방법입니다. 특히 바이러스의 경우는 genome이 작기 때문에 특히 분자생물학적 방법이 많이 이용된다.  핵산결합법 (nucleic acid hybridization)은 세포나 조직에 특정한 바이러스의 genome이나 유전자가 존재하는 지를 조사할 때 이용된다.  이 방법은 genome과 결합할 수 있는 (hybridize) 핵산 (probe)을 합성하고, 이 핵산을 방사능 등으로 표지한 다음, 이 probe 핵산과 결합하는 바이러스 genome이나 유전자가 존재하는 지를 조사하는 것이다.  이 방법은 더 나아가 바이러스의 특정한 유전자를 분리해낼 때에도 이용된다 (viral gene cloning).

     바이러스는 genome이 작기 때문에 바이러스 genome 전체를 분리해내고 그 염기배열을 밝힐 수도 있다.  더 나아가 분리된 바이러스 genome을 이용하여 시험관에서 특정한 유전자의 돌연변이를 유도 할 수도 있다 (in vitro mutagenesis).

 

     최근에는 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 바이러스의 genome을 조사하는 방법이 많이 이용되고 있다.  이 방법은 특히 바이러스가 지속감염을 하면서 아주 소수의 바이러스만을 증식시킬 경우 몇 개 안 되는 바이러스 genome이나 유전자의 존재를 확인할 때 많이 이용된다.  이 방법은 적은 수 존재하는 바이러스 genome이나 유전자, 전사체 등을 증폭해 낼 수 있는 방법으로 조직 중에 비록 한 개의 genome만이 있다하더라도 곧 수만 개의 genome으로 증폭시킬 수 있는 방법이다.  이 방법은 또한 바이러스의 genome이나 유전자를 클로닝할 때에도 이용된다.  




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