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미생물이야기 곰팡이는 자연계의 모든 영역을 차지하는 미생물로 자연계로부터 미생물을 분리
2013-08-13 11:47:44
이엠생명과학연구원

(1) 시료채취와 수집방법

곰팡이는 자연계의 모든 영역을 차지하는 미생물로 자연계로부터 미생물을 분리하기전에 흥미있는 산물이 무엇인지와 시료채취할 생태계의 구조를 이해하는 것이 중요하다. 시료는 멸균 장갑, 쪽집게, 핀셑, 외과용 수술칼이나 혹은 국자를 이용하여 채취하고 NaSCO Wrilpack 가방 혹은 병에 무균적을 놓고 즉시 사용하거나 5˚C에서 하룻밤 보관한다. 토양시료를 채취할 때 특정 토양의 수질영역, 잎부스러기와 쇄석, 뿌리근처 토양, 모래, 자갈, 바위가 포함되어야만 한다.

식물의 잎, 줄기, 껍질, 뿌리, 꽃 등이 곰팡이 분리에 유용할 수 있고 식물부위의 형태, 크기와 생리적 상태, 표면의 조건, 개개의 식물위치와 생태계 등의 관계를 고려하여 분리된 곰팡이의 종류를 부분적으로 결정할 것이다.

물시료는 하구, 하수, 연못, 해양, 급류 등에서 수집할 수 있고 적어도 50ml의 물을 멸균된 병으로 수집하여야만 한다.

 

 

(2) 생태적 요인과 배지

곰팡이와 영양요구성은 그들의 서식지 만큼 다양하다. 한 배지에서 한가지 조성을 바꾼 배지가 어떤 한 가지의 곰팡이를 분리하는데 사용된다. 따라서 모든 곰팡이에 적용되는 곰팡이 분리용 배지는 존재하지 않는다. 분리할 곰팡이의 형태 뿐만 아니라 채취할 생태계의 물리적 인자(즉, pH, 염도, 영양원, 온도) 등이 분리용 고체배지를 개발하는데 고려되어야만 한다. C/N비가 낮은 배지를 이용하는 것이 분리에 보다 효율적이고 동정에도 유용하다. Plate는 쌓아서 배양하고 뒤집지 말아야만 된다. 낮은 온도(5-15˚C)가 저온균을 분리하는데 적당하고 20-35˚C가 중온균을 분리하는데 적당하며, 45-50˚C가 고온균을 분리하는데 적당하다. 선택적 집적과 저해배지의 조합이 동시에 사용된다.

 

(3) 선택적 집적

선택적 집적은 다른 종을 넘어 한가지 종의 분리를 촉진시키기 위해 행해진다. 시료 환경으로부터 멸균된 기질(토양 추출물, 식물의 추출물)을 빈약한 배지에 첨가하는 것이 곰팡이를 집적하기 위한 단순하고 효율적인 방법이다. 예를 들면 포도즙에서 발견되는 동일한 당류를 가지는 배지(즉, grape juice/yeast extract와 grape juice/live extract)에서 분리되는 효모의 수나 종류가 표준효모배지에서 분리된 것보다 클 것이다. 삼투압에 민감한 효모는 멸균된 식물부위를 water agar에 첨가하여 분리한다.

높은 염내성을 가지는 호알칼리성 곰팡이를 분리하기 위해서는 배지에 여러가지 농도로 바다염을 포함시키고 pH를 알칼리로 조성하는 것이 유리하다.

 

(4) 세균의 저해

원하지 않는 미생물을 배제하므로 선택적 저해배지의 기능을 하게 된다. 배지에 chloroamphenicol, kanamycin, penicillin, streptomycin과 tetracycline 같은 항생물질을 첨가하여 세균의 colony 출현을 저해한다. 세균을 저해하는 또 다른 방법은 사용하기 전에 3일이나 4일동안 plate를 건조시키는 것, 배지와 pH를 낮추는 것, 혹은 낮은 pH가 좋지 않을 때 rose bengal(1:30,000)을 배지에 첨가하는 것이 있다.

 

(5) 토양으로부터 곰팡이의 분리

① 이식방법(implant method)

멸균된 spatula나 pick을 사용하여, agar의 끝부위에 토양의 적은 입자를 놓는다. 시료를 agar안으로 가볍게 눌러준 후 배양한다.

② 희석법

멸균수나 다른 희석액 9ml를 포함하는 일련의 시험관을 만든 후 한 희석 시험관에 토양1g을 올려놓고 15분동안 교반한다. 연속희석하여 최종의 재 희석액을 agar plate에 0.1ml 접종하고 멸균된 구부러진 유리봉으로 평판하여 배양한다.

③ War cup법

Petridish에 적은 양의 토양을 올려 놓고 소량의 멸균수로 분산시킨 후 녹인 한천을 plate에 붓는다. 이 방법은 늦게 자라는 곰팡이의 분리에 유용하다.

④ Stamping법

Polyurethane foam의 작은 원통(




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