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미생물이야기 토양으로부터 정확한 생균 평판계수를 위하여 토양입자에 붙어있거나
2013-08-13 12:45:29
이엠생명과학연구원

배양방법

 

1. 계수와 분리기법

 

1.1 토양으로부터 세포의 추출

토양으로부터 정확한 생균 평판계수를 위하여 토양입자에 붙어있거나 토양 덩어리의 공극에 있는 미생물들을 효율적으로 추출할 필요가 있다. 흔히 사용하는 방법은 glass bead를 넣거나 없이 맨손이나 기계적으로 흔들기, 기계적인 혼합, 그리고 초음파 파쇄를 포함한다. 다른 추출용액이 토양의 pH와 조직에 따라 사용될 수 있다. Tween 80같은 계면활성제가 사용될 수 있으며 흔히 sodium pyrophosphate 같은 분산제가 함께 사용된다.

 

1.2 희석단계

추출단계 다음으로는 각 복제 단위로 미생물을 분리하기 위한 시료의 연속 희석이 수행된다. 멸균수, 생리 식염수, 완충 펩톤 또는 인산용액은 이 단계에서 흔히 사용되는 용액들이다. 물은 흔히 편리하게 사용되지만 희석과정 중에 삼투충격을 주기 때문에 좋지 않다.

 

1.3 물 시료의 농축단계

해수, 음용수와 같은 일부 환경 시료들은 적은 수의 세균을 포함하기 때문에 계수 전에 희석보다는 농축을 해야 한다. 이 방법에서, 일정 부피의 물은 진공을 사용하여 막을 통해 여과된다. 세균은 막에 걸려 한천 배지나 배지에 적셔진 셀룰로오스 패드에 놓여 개개의 집락으로 자라난다. 이것이 막여과 기법 (membrane filtration technique)의 기본이다. 분리와 계수 목적을 위해 적절한 부피와 적절한 막의 종류와 크기를 선택하는 것이 중요하다. 흔히 공극 크기가 0,.45 ㎛인 니트로셀룰로오스 여과막이 사용된다.

 

 

2 평판 방법

 

희석과 농축이 끝나고 시료는 선택적 영양소가 혼합된 한천으로 구성된 생장 배지 [media (복수), medium (단수)]를 담은 페트리접시에 넣어진다. 도말평판 (spread plate) 법에서는 시료의 선택된 희석물의 0.1-ml 분별액 (aliquot)을 멸균된 유리봉을 이용하여 고체 한천의 윗 부분에 균일하게 도말한다. 주입평판 (pour plate) 법에서는 적절한 시료 희석액의 1-ml 분별액은 페트리접시에서 녹인 한천 (45℃)으로 혼합하여 굳힌다. 도말평판 기법은 한천의 표면에서 집락을 생성하고, 형태에 근거하여 다른 미생물을 쉽게 식별할 수 있도록 하는 장점이 있다. 또한 나아가 집락의 분리를 용이하게 한다. 도말평판 기법은 일반적으로 주입평판법보다 더 많은 세균 계수를 얻을 수 있게 되는데 아마도 이 방법으로 통기성을 증진시키고 세균의 덩어리를 분산시키기 때문이다.

평판 접종 후 시료들은 특정 조건 하에서 배양된다. 세균은 집락형성 단위 (colony-forming unit, CFU)라고 하는 육안으로 보이는 분리된 집락으로 증식되도록 한다. 각 집락형성 단위가 단일 세균세포에 기원하기 때문에 평판 접종 이전의 희석단계에서 생물체들이 개별적인 복제 단위로 분리되는 것이 중요하다. 그러나 실제로, 집락은 세균의 사슬이나 덩어리로부터 생겨날 수 있으므로 진정한 세균수의 과소평가를 가져올 수 있다. 계수할 수 있는 집락의 범위는 표준 150 mm 직경의 한천 평판 상에서 30-300 이다. 30 이하에서 정확도는 감소되며; 300 이상에서는 정확도가 약간만이 증가하며 실제로는 평판 상에서 자라는 생물체간의 과밀생장과 경쟁에 의해 개체수가 감소된다.

미생물의 계수를 위한 표준 평판계수법은 미생물학에서 가장 오래되고 가장 널리 사용되는 기법이다. 그러한 인기에도 불구하고, 희석과 평판기법은 그 방법의 시작 때부터 많은 정밀한 조사와 비판을 받아왔다. 주요 비판 중의 하나가 현미경적으로 관찰된 것처럼 총 개체군의 작은 일부만이 실험실 배지에서 배양될 수 있다는 것이다. 직접 현미경 계수로 관찰된 세포의 1~10% 만이 평판계수법을 사용한 생균으로 회수될 수 있다. 방법 간의 이런 커다란 불일치는 몇 가지 요인 때문이다. 먼저 적은 기질 수준의 환경시료에는 매우 서서히 자라거나 배양 불가능한 영양이 고갈되거나 빈영양성 생물체가 보편적으로 서식하는데 이들은 비교적 짧은 시간에 집락으로 나타나지 않는다. 둘째로, 살아있는 생물체는 추출과 희석 과정 중 그들에 주어진 스트레스 때문에 배양되지 않는다. 다른 이유는 집락을 형성하기 위하여 세균 간에 나타내는 경쟁이 일부 미생물의 생장을 억제한다는 것이다. 이같이, 일부 미생물은 평판배지 상에서 매우 서서히 자라거나 전혀 자라지 않는다. 대부분의 자연 환경은 빈영양 상태이기 때문에 평판배지의 영양상태는 생균 계수를 수행하는데 고려되어야 할 중요한 점이다. 많은 토양 분리균주는 영양배지에서 보다 영양이 부족한 배지 상에서 더 잘 자란다. 마지막으로, 살아있는 세균의 회수의 변동은 추출단계 중 토양입자로부터 세균의 불만족스러운 방출 또는 희석단계 중 세균의 분리가 부실하기 때문일 수 있다. 이것은 단일 집락을 생기게 하는 세균의 덩어리를 허락하여 존재하는 집락이 적어지는 결과를 가져온다. 이들 요소가 직접계수와 생균계수에서 10 내지 100배의 차이가 관찰되는 결과를 가져온다. 일반적으로 계수에서 이 차이를 가져오는 세포들은 살아있으나 배양되지 않는 것으로 고려되며 죽은 세포들은 빨리 분해되고 이용되는 것으로 가정된다.

 

 

3. 최확수 기법

 

최확수 (most probable number, MPN) 기법은 흔히 환경에서 미생물 개체수를 측정하기 위하여 표준 평판계수법을 대신하여 사용된다. 이 방법에서 분석된 시료는 추출 용액에 분산되고 평판계수에서처럼 연속적으로 희석된다. 이 방법은 개체군의 희석 후 각 희석의 특별한 액체배지를 포함하는 5~10개의 복제 시험관 (replicate tube)에의 접종에 의존한다. 접종 후, 시험관은 탁도, 가스생성, 기질의 생성과 소멸 등의 요인 같은 요인들에 기초한 생장에 따라 +/- 로 표시된다. 생장이 양성인 시험관의 숫자는 적어도 하나의 배양할 수 있는 생물체가 접종에 사용된 희석에 존재하는 것을 의미한다. 각 희석체에서 양성과 음성 시험관의 수는 발표된 통계적 MPN 표를 통해 원 시료에 존재하는 수를 계산하는데 사용된다. MPN 표는 American Public Health Association (1992)에서 찾아볼 수 있다.

배양 전 액체 농화배양을 요구하는 미생물을 계수할 때 MPN 분석의 사용은 의무적이다. 많은 식품, 퇴적물, 그리고 토양을 분석하는데 필수적이기도 하다. 그러나 MPN 기법은 많은 노동력이 필요하며 그 결과는 보통 직접 평판방법에서 얻어지는 것보다 덜 정확하다.

 

 

4. 세균배양용 배지

 

 

4.1 세균배양에 사용되는 일반 배지

미생물의 배양을 위한 배지는 생장을 지원하는 물질을 포함해야 하며, 이용할 수 있는 배지는 미생물에 따라 다양하다. 많은 배지는 Difco (Detroit, MI)나 BBL (Cockeysville, MD) 같은 상업적 제조회사로부터 이용할 수 있다. 미생물 배지의 중요 성분은 (1) 종속영양성 세균을 위한 포도당이나 독립영양성 세균을 위한 CO2 같은 생체량으로의 동화를 위한 탄소원; (2) 생장을 위해 필요하며 보통 암모니아, 단백질, 아미노산, 펩톤, 식물이나 고기로부터의 추출물로서 공급되는 질소; (3) 적절한 pH를 유지하기 위한 완충용액; 그리고 (4) 특정한 미량 무기물이나 금속 같은 생장 요소, 또는 환경시료 자체로부터 만들어진 추출물에서 발견되는 확인되지 않은 요소들. 한천은 배지에서 사용되는 가장 흔한 고형화 물질 (solidifying agent)이다. 한천은 해양 조류에서 추출되는 다당류로서 고온에서 액체로 존재하지만 38℃로 식히면 굳어진다. 한천은 배지에서 영양적 가치를 공급하지는 않으나 여러 종류의 한천에서 다양한 생장이 관찰된다. 세균은 이 고형물질이 없는 액체배지에서 배양되기도 한다. 많은 배지는 또한 비표적 생물체의 생장을 억제하는 반면에 특별한 생명체의 생장에 좋은 선택적 성분도 포함한다.

배양배지가 일반적으로 특별한 미생물을 계수하거나 분리하는데 사용되는데 반하여, 그들은 또한 미생물 분리균주의 동정을 위한 대사 지문 (metabolic fingerprinting) 분석에도 사용될 수 있다. 그 같은 체계는 그람 음성 미생물의 임상적 동정을 위해 일상적으로 사용되는 API strips (Analytab Products)과 Enterotube (Roche)를 포함한다. 환경미생물학에서 대사 지문 체계의 가장 흔한 사용이 Biolog이다. Biolog는 단일 분리균주의 동정뿐만 아니라 군집 조성의 분석을 위해서도 사용된다. Biolog system의 기본은 92개의 well에 다른 탄소 기질을 포함하는 96-well microtiter plate이다. 각 well에 동일한 분리균주나 군집 시료를 접종한다. 만일 기질이 이용되면 well은 보라색이 된다. 평판은 수작업이나 plate reader를 사용하여 자동적으로 읽을 수 있다. 결과는 그후 Biolog에 의해 제공되는 데이터베이스와 비교된다 (분리균주의 경우). 환경 분리균주를 위한 이 체계의 결점 가운데 하나는 데이터베이스가 많은 분리균주의 동정에 충분히 제공하지 못한다는 것이다.

 

 

4.2 종속영양 평판계수

종속영양성 세균은 유기물질에서 에너지와 탄소를 얻으며, 토양이나 물에서 총 종속영양성 개체군의 개체수를 얻는 것이 종종 바람직하다. 종속영양 평판계수는 토양의 일반적인 “건강”의 지표로서 그리고 토양 내에서 유기물질의 이용도를 나타낸다. 부영양 배지 (nutrient-rich medium)빈영양 배지 (nutrient-poor medium)의 두 가지 기본배지가 이 분석에 사용된다. 부영양 배지에는 고농도의 펩톤, 효모, 소고기나 토양의 추출물을 포함한다. 빈영양 배지는 흔히 최소배지 (minimal medium)라 하며 이들 성분이 최고 75% 적으며 흔히 대체물로서 카제인, 포도당, 글리세롤, 또는 젤라틴을 포함한다. 최소배지에는 R2A agar (BBL, Difco), m-HPC agar (Difco), 그리고 부가물이 없는 토양추출물 한천배지 (soil extract agar)가 있다. 많은 경우에, 환경에서 많은 수의 빈영양성 생물들이 부영양 배지에서 배양될 수 없기 때문에 보다 많은 수의 집락이 최소배지에서 얻어질 수 있다. 이는 대부분의 물과 지하의 다공성 매질 시료에서 나타나며 이를 위하여 빈영양 배지인 R2A가 흔히 사용된다 (그림 10.5). 빈영양 배지 상에서의 생장은 오래 걸릴 수 있으며 (5-7일), 집락의 크기는 보통 부영양 배지 상에서보다 작다. 더욱이 단일 시료로부터의 분리균주의 군집은 두 가지 배지 종류에 평판배양 되었을 때 전혀 다르게 나타날 수 있다.

 

 

4.3 특정 미생물 개체군의 배양

환경시료에서 발견되는 세균의 총 개체군으로부터 종종 특정한 미생물 개체군, 심지어 매우 특별한 세균 분리균주를 검출하거나 계수할 필요가 있다. 이것은 한 가지 또는 그 이상의 특별한 배지로 배양할 필요가 있으며 흔히 대상 환경 생물체의 최대배양능력을 보장하기 위하여 실행되는 특별한 단계를 요구한다.

전-농화 배지 또는 소생 배지 (pre-enrichment medium 또는 resuscitation medium)는 환경시료에 있는 미생물들이 활동적으로 대사하고 수적 증가를 시작하도록 하는 액체배지이다. 전-농화배양에는 두 가지 목적이 있다. 먼저, 손상된 세포에 회복하고 생장하는데 시간과 필요한 영양소가 주어진다. 이 단계는 선택 농화배지에의 시료의 직접접종이 일부 세균의 죽음을 가져올 수 있기 때문에 중요하다. 이것은 특히 아치사적으로 손상된 생물에서 결정적인데 선택조건 하에서 회복될 수 없다. 전-농화의 두 번째 단계는 세포 수가 증가하는 것으로 환경시료에서 낮은 수의 대상 생물체를 계수하려 할 때 결정적이다.

농화배지 (enrichment medium)는 경쟁적 배경 균총 (bagground flora)의 생장을 억제하는데 반하여 생물체 혼합에서 존재하는 특별한 생리적 형태의 생장을 촉진하는 액체배지이다. 그것은 시료가 높은 개체군의 정상균총 (normal flora)을 포함할 때 요구되는 환경 분리균주의 검출을 돕는다. 농화배양은 임의적 또는 선택적이다. 임의적 농화배지 (elective enrichment medium)는 영양적 또는 생리적 속성의 독특한 조합에 의거한 단일 또는 제한된 종류의 세균의 생장을 허락한다. 선택적 농화배지 (selective enrichment medium)는 원하는 생물체의 생장을 허락하는데 반하여 대부분의 생물체의 생장을 억제하거나 저해하는 억제물질이나 조건의 사용을 수반한다.

 

 

선택적 평판배지 (selective plating medium)는 요구되는 생물체의 생장을 촉진하는데 반하여 한 가지 군의 생물체의 생장을 억제하거나 막는 한천배지의 변형이다. 항생물질은 가장 널리 사용되고 효과적인 선택요인이다. 생장배지에 흔히 첨가되는 선택요인의 다른 예는 수은이나 납과 같은 금속인데 이들은 무기염 배지에서 보통 사용된다. 선택은 고농도의 염과 염료와 같은 독성화합물의 사용에 의해 수행되기도 한다. pH나 삼투조건의 조절도 선택을 위해 사용된다. 마지막으로 접종된 생장배지의 접종조건에 의존하기도 한다. 이들에는 온도나 산소 수준 등이 포함된다.

 

 

특수 분리 배지 (special isolation medium)는 특별한 생물군의 영양적 요구를 충족하는 조성을 포함하며 그에 따라 구별 및 동정이 가능하다. 감별배지 또는 분별배지 (differential medium)는 동일한 배지에서 자라는 다른 미생물의 구별을 가능하게 하는 성분을 포함한다. 영양요구의 다양성이나 여러 탄소원으로부터 산이나 알칼리의 생산에 근거한 어떤 생물체의 군을 식별하기 위하여 보통 pH를 위한 것과 같은 지시약을 포함한다.

 




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