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미생물이야기 다양한 미생물 배양법에 대해 알아보자.
2013-08-13 14:01:10
이엠생명과학연구원

미생물 배양방법

1. 진균 배양법

진균은 종속영양성 생물체이며 대부분 자연에서 호기성이거나 미호기성이다. 진균은 형태학적 그리고 물리적으로 다양하여 배양기법에 의해 정량하거나 동정하기가 매우 어렵다. 진균의 배양방법은 세균에서의 방법과 유사하지만 세균의 생장을 막기 위해 변형시켜야 한다. 보통 항생물질이나 Rose Bengal과 같은 염료를 첨가하거나 배지의 pH를 낮추어야 한다. 그러나 진균의 배양법은 정량적 희석과 평판분석에 적절하지 못하다. 왜냐하면 계수는 포자를 형성하는 진균의 존재로 크게 벗어날 수 있기 때문이다. 이 경우에, 집락은 포자로부터 생겨날 수 있고, 얻어진 배양할 수 있는 집락의 개수는 환경시료에서 집락의 수를 제대로 반영한 것이 아닐 것이다. 진균의 집락은 단일 포자, 포자 덩어리, 또는 하나 이상의 살아있는 세포를 함유한 균사 조각으로부터 발달될 수 있다. 이런 제한점을 명심하면서 평판 기법이 여전히 환경에서 진균의 평가를 위한 가치있는 도구임을 기억하라. 진균을 배양하는 기법은 주입평판법, 도말평판법, 그리고 막여과법을 포함한다. 진균의 배양을 위해 구체적으로 관련된 이들 방법들은 “물과 폐수의 검사를 위한 표준방법 (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater"에서 찾아볼 수 있다 (Methods 9610B, C와 D). 희석과 평판기법의 변형법에는 영양한천배지 상에 연속적으로 도말평판한 시료에서 직접 진균의 균사를 선택하거나 토양 (혹은 식물의 뿌리)을 세척하고 한천배지 상에 소량의 세척된 시료를 올려놓는 것을 포함한다.

일반적 배양은 질소원으로서 질산을 사용하고 배지를 산성 pH에 맞추는 것을 포함한다. 이미 언급한 바와 같이, crystal violet이나 Rose Bengal, streptomycin과 같은 광범위 항생물질과 같은 생장 억제제의 부가에 의해 진균의 계수를 돕기 위하여 세균의 생장을 억제시킬 필요가 있다. 4~10℃의 낮은 배양 온도도 생장배지 상에서 진균이 세균보다 우세하게 자라도록 돕는다. 평판 당 계수할 수 있는 집락의 최적 개수는 약 100개 정도이다.

흔히 과학자는 생리적으로 특이한 진균류 또는 담자균류와 균근균 (mycorrhizal fungi)과 같은 특별한 부류를 분리하는데 관심이 있다. 다양한 선택배지가 이러한 목적을 위해 개발되었다. MPN 기법은 균근균의 계수를 위해 흔히 사용되는데 이는 평판배지에서 잘 자라지 못한다. 이 기법에서 토양 희석액은 영양배지 대신 숙주식물을 접종하는데 사용된다. 특별 배양 후 식물의 뿌리는 진균에 의한 집락 형성이 관찰되며 본래 시료에 존재하는 개체수를 측정하기 위하여 MPN 표를 사용하여 계산한다. 환경시료로부터 진균의 초기 분리 후 개개의 집락은 추후 정제와 동정을 위해 선택되어야한다.

 

 

2. 조류와 시안세균의 배양방법

조류는 담수와 해수, 그리고 습윤 토양에서 발견되는 단일 또는 다세포성 광영양성 진핵 미생물이다. 이와 달리 소위 “남조류 (blue-green algae)"는 진정한 조류가 아니며 오히려 그들은 시안세균 (cyanobacteria)이라고 알려진 세균에 속한다. 대부분의 토양 조류는 무기영양소로부터 유기 화합물을 합성하는데 빛을 이용하는 절대 광독립영양체이다 (광영양성 진핵생물체). 이같이 그들의 영양 요구성은 물, 빛, 산소, 이산화탄소, 그리고 무기영양소를 포함한다. 일부 조류는 생장을 위해 유기 화합물을 필요로 하는 광종속영양체이다. 조류와 시안세균은 일부 변형된 희석과 평판기법뿐 아니라 MPN 분석에 의해 계수될 수 있다. 고체배지에서 미세조류의 집락형성 단위를 계수할 때 빠르게 생장하는 종속영양성 세균과 진균의 존재 하에 조류의 생장을 보장하기 위하여 조류 배지에 페니실린과 스트렙토마이신과 같은 항생물질을 첨가하는 것이 추천된다. 다른 방법으로는 저 수준의 자외선 조사 또는 formaldehyde나 sodium lauryl sulfate 같은 비특이성 살세균제에의 노출이 세균의 생장을 억제하는데 사용될 수 있다. 1~3주 또는 그이상의 배양기간이 필요하기도 한데 그 배지의 건조가 일어나지 않는 특별한 배양이 요구된다. 추천되는 공기온도는 12시간 명-12시간 암 혹은 16시간 명-8시간 암 등의 광주기 하에서 20~25℃이다.

 

 

3. 세포배양에 근거한 바이러스 검출방법

바이러스의 증식에는 살아있는 세포가 필요하며 본래 사람 자원자, 실험실 동물, 또는 배발생 중인 계란 등이 인간 바이러스를 연구하고 분리하는데 이용할 수 있는 유일한 방법이었다. 그러나 제2차 세계대전 이후 동물세포 배양기술의 도래는 동물바이러스의 연구에 혁명을 가져왔으며 처음으로 바이러스가 동물 없이 생장되고 분리될 수 있었다. 세포배양의 두 가지 주요 형태가 바이러스학에서 사용되는데 첫 번째 것이 일차 세포배양 (primary cell culture)이다. 이 방법에서 세포는 동물로부터 직접 제거되어 제한된 횟수동안 (20~50 통과) 바이러스 세포를 계대배양하기 위해 사용될 수 있다. 이같이 동물은 필요한 세포를 공급하기 위해 연속적인 토대 위에 이용될 수 있어야 한다. 일차 원숭이 신장세포배양 (보통 rhesus 또는 green monkey)이 허용되었거나 또는 많은 보통 인간 바이러스의 증식을 허용하며 환경에서 장내 바이러스의 검출에 한때 통상적으로 사용되기도 하였다. 세포배양의 두 번째 형태는 연속 세포배양 (continuous cell culture)으로 알려져 있다. 연속 세포주 (cell line)는 또한 동물이나 사람으로부터 유래하지만 무한적으로 배양할 수 있다. 그러한 세포주는 정상 또는 암 조직에서 유래하기도 한다.

불행하게도 모든 동물성 바이러스는 동일한 세포주에서 자라게 되는 것은 아니며 Norwalk 바이러스를 포함하는 다른 바이러스들은 세포배양에서 이제까지 결코 자라지 않았다. 바이러스는 숙주세포에 부착하고 증식을 위한 특별한 수용체를 요구하며 만일 없다면 증식이 일어나지 않는다. 예를 들면 로타바이러스 (rotavirus)는 MA-14 세포주에서 잘 자라나 BGM 세포주에서는 그렇지 않다. 물에서 엔테로바이러스 (enterovirus) 검출에 가장 흔하게 사용되는 세포주는 BGM 세포주이다. 최근에 사람의 직장암에서 얻어진 세포주인 CaCO2는 어떤 다른 세포주보다 더 많은 종류의 장내바이러스 (enteric virus; hepatitis A, astrovirus, adenovirus, enterovirus, rotavirus)가 자라날 수 있는 것이 밝혀졌으며 환경바이러스학에서 점차 사용이 증가되고 있다.

세포주에서 바이러스를 검출하고 정량하는 두 가지 가장 흔한 방법은 세포병변 효과 (cytopathogenic effect, CPE) 방법과 용균반 형성 단위 (plaque-forming unit, PFU) 방법이다. 세포병변 효과는 바이러스 증식의 결과로서 숙주세포에서 일어나고 관찰될 수 있는 변화이다. 모든 바이러스가 주어진 세포주에서 증식하는 동안 CPE를 형성하는 것은 아니다. 더욱이 바이러스는 더욱 많이 자라게 되기도 하나 CPE가 모두 관찰되는 것은 아니다. 이러한 경우에 바이러스 검출을 위한 다른 기법이 사용되어야 하는데 바이러스 항원을 검출하는 면역분석의 사용이나 바이러스 핵산을 검출하기 위한 PCR의 사용을 포함한다.

환경시료에서 분리된 바이러스는 흔히 감염된 동물이나 사람에서 직접 나오며 세포배양에서 빠르게 자라지 않는다. 두 가지 방법이 CPE를 이용하여 바이러스를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 첫 번째는 연속희석 적정점 (serial dilution endpoint) 또는 TCID50 방법 (TCID50 method)으로 숙주 세포에 바이러스 현탁액의 연속희석을 넣어서 시간의 경과에 따른 CPE의 생성을 관찰하는 방법이다. 두 번째 방법은 MPN 방법으로서 세균의 계수에 사용되는 방법과 유사하다. 이 방법은 바이러스 현탁액의 여러 다른 희석으로 접종된 단일층에서 CPE를 관찰하고 바이러스의 수를 결정하기 위하여 MPN 표를 사용한다.

세포배양은 전자현미경의 사용으로 관찰될 수 있는 모든 바이러스 입자를 검출하는데 100% 효과적이지 못하다. 이것은 모든 입자들이 감염성이 아니기 때문이다. 비감염성 바이러스 입자는 캡시드 내에 핵산을 가지지 않거나 핵산이 불완전하기 때문이다. 세포배양의 비효율성의 다른 이유는 세포 수용체의 결핍이나 세포배양기간이 숙주세포 상의 바이러스 수용체에 모든 바이러스가 부착하는데 불충분하기 때문이다. 더욱이 용균반의 효율이나 CPE의 생산이 염, 첨가물, 또는 배지 내에 부가된 효소의 영향을 받는다. 일반적으로 실험실에서 자란 바이러스의 경우 총 바이러스 입자에 대한 PFU나 감염성 바이러스의 비율은 1:100이지만 숙주나 환경으로부터의 바이러스는 더욱 커야할지도 모른다 (1:10,000). 이러한 이유로 바이러스 게놈의 1~10 복사체 (copy)를 검출할 수 있는 PCR 같은 기법은 전통적인 세포배양 방법보다 더욱 민감하다.




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