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미생물이야기 생균수 측정과 동일한 방법으로 얻는 방선균을 평판에서 사면배지(slant)로 순수분리한다.
2013-08-13 15:04:43
이엠생명과학연구원

1. 분리와 보전

생균수 측정과 동일한 방법으로 얻는 방선균을 평판에서 사면배지(slant)로 순수분리한다.세균이나 사상균이 혼입된 경우는 평판에 도말하여 재 분리한다. 토양 중에서 생육할 때와 같은 생리적 특성을 유지시키기 위해서는 분리, 보전용 배지가 영양이 높은 것은 좋지 않다. 어떤 종류의 균은 보존시에 공기중 균사를 만들기 용이한 배지를 사용하는 편이 장기간 보존되는 경우도 있다. 한번 잡균이 혼입되면 재분리가 어려운 경우가 많으므로 순수분리할 때 옅은 희석현탁액을 사용하는 것이 좋다. 포자를 만들지 않는 방선균은 배지가 건조하면 사멸될 수 있으므로 2개월에 한번, 포자를 형성하는 것은 4개월에 1번 정도 계대배양할 필요가 있다. 냉동 글리세롤에 보존하는 방법은 포자나 균사를 살균된 10%(V/V) glycerol에 현탁시켜 이를 -20℃ 또는 그 이하로 cap tube에 보존하고 접종원으로 필요할 때는 현탁액을 녹여서 소량을 피펫이나 loop로 무균적으로 옮긴다. 사용 후 cap tube는 즉시 냉동상태로 되돌려야 하고 이 방법은 적은 노력으로 편리한 접종원을 제공하며 오염 위험이 적다.

현탁액이 얼은 상태로 있으면 장기간 보전이 가능하다. 동결건조법은 잘 확립된 보전방법이지만 glycerol법보다 많은 시간과 설비가 필요하다. Bacto skim milk powder(Difco) 10% 용액을 121℃에서 5분간 살균한다. Whatman No.3 여과지를 약 5㎜넓이로 잘라서 샤레에 넣어 살균하고 앰플(ampoule)은 마개를 막지 않은 상태로 건열살균 시킨다. 보존용 배양체는 적당한 사면배지에 25∼30℃로 7∼14일간 배양한다.

Skim milk용액을 배양된 시험관에 넣고 loop로 배양표면을 문질러 현탁시킨다. 여과지에 현탁액을 흡수시킨 뒤 살균된 ampoule에 넣는다. 이것을 최소한 4시간 이상 진공건조시킨 후 gas버너 등을 이용하여 봉합시킨다.

 

2. 분리와 동정

토양을 시료로 사용하는 경우는 다수의 방선균을 동정해야 되며 흔히 검출되는 것은 종 또는 종 group까지, 검출빈도가 낮은 것에 대해서는 속까지 동정되고 있다. 분리균주는 여러 가지 배지를 사용하여 중온균은 25∼30℃, 고온균은 45∼55℃에 생육시킨다. 콜로니 형성은 고온균은 1∼3일, 중온균은 7∼14일이 요구된다. 살균된 cover slip을 배지에 약 45°로 끼워서 배지를 만난 선을 따라 slip 사면에 생육시킨 후 cover slip을 조심스럽게 들어내어 생육이 좋은 slid를 염색하지 않고 저배율로 검경한다. 다음은 풍건시키고 alkaline methylene blue로 3분간 염색 후 세척하고 화염건조시킨 후 lmmenrsion oil을 사용하여 검경한다.

기중균사와 영양균사의 차이점은 육안으로 볼 때 기중균사는 건조한 분말상의 솜같이 나타나며 영양균사는 탁하고 평탄하게 보인다. 염색하지 않고 검경할 때는 기중균사는 영양균사보다 어둡게 보인다. 또한 영양균사는 cover slip을 이용하면 표면에 1면의 초점을 갖으나 평판에서는 여러 면의 초점을 갖게 된다.

방선균의 분류, 동정은 Waksman을 효시로 많은 연구자들에 의하여 제안되었으며 “Bergey’s manual 7판”, “미생물의 분류와 동정” 등의 참고서를 이용하면 좋은 것이며 여기서는 Kuster의 분류법을 사용한다.

Actinomycetales

  (Ⅰ) 영양균주가 균상으로 계열하는 것 ,호기성 또는 혐기성

a) Actinomyces : 기중균사는 없음. 통성혐기성, catalase음성, 세포벽은 lysin, gluam- ic acid, alanin, galactose를 함유

b) Odontomyces : 통성혐기성, Catalase음성

c) Dermatophilus : 기중균사는 없음. 통성호기성. 운동성이 있는 포자를 만든다. 세포벽은 III형

d) Promicromonospora : 기중 균사는 거의 없음. 단일 포자를 짧은 포자병 또는 영양균사에 착생한다. 포자벽은 lysin, glutamic acid, alanin, galactose를 함유

e) Nocardia type Madulae : 기중 균사가 거의 없음. 경우에 따라서는 구형의 포자를 연쇄상으로 만든다. 호기성이며 세포벽은 Ⅱ형

f) Nocadia type Asteroides : 호기성이며 세포벽은 IV형

g) Micropolyspora : 기중균사를 갖고 있는 포자는 기중균사 및 영양균사를 만든다. 호기성이며, 세포벽은 Ⅳ형이다.

  (Ⅱ) 영양균사는 단열하지 않음. 호기성.

(A) 포자가 포자낭에는 만들어 지지 않음.

(A-1)단일의 포자가 형성되는 것

h) Micromonospora : 기중균사 없음. 세포벽은 II형. 중온성

i) Thermomonospora : 기중균사가 있고 기중균사에만 포자를 착생한다. 세포벽은 Ⅳ형. 호열성

j) Thermoactinomyces : 기중균사가 있음. 포자는 기중균사 및 영양균사에 착생한다. 세포벽은 Ⅲ형

(A-2) 2개의 포자가 생성되는 것

k) Microbispora : 기중균사에만 착생. 포자벽은 Ⅲ형

(A-3) 연쇄상의 포자가 기중균사. 때때로 영양균사에 형성되는 것

l) Streptomyces

(B) 포자는 포자낭 중에 생성함. 또는 연쇄상의 포자가 형성되는 경우도 있음

(B-1) 포자운동성이 있다.

m) Actinoplanes : 기중균사는 없고 포자낭은 구형 또는 일정한 형태를 갖지 않음. 포자는 구형에 가까움. 세포벽은 Ⅱ형.

n) Ampulariella : 기중균사는 없음. 포자낭은 단주형으로부터 병형. 포자는 탁형

o) Spirillospora : 기중균사가 있음. 포자낭은 구형으로 포자는 탁형 또는 촉선상. 분생포자를 만드는 경우도 있다.

(B-2) 포자운동성이 없음

p) Strptosporangium : 기중 균사 있음. 포자낭은 구형으로 세포벽은 Ⅱ형

q) Amorphosporangium : 기중균사가 있음. 포자낭은 부정형으로 세포벽은 Ⅱ형

r) Microellobosporia : 기중균사가 있음. 포자낭은 곤봉상이고 구형의 포자를 일렬로 만든다. 포자낭은 영양균사와 기중균사로 될 수 있다. 세포벽은 I형

세포벽의 조성

glycin

LL-DAP

Meso DAP

arabinose

galactose

+

+

* * *

+

 

+

* *

* *

+

* *

* *

+

+

+

DAP : diaminopinelic acid

2.1 Streptomyces의 분류법

Streptomyces종을 동정할 때 성숙한 방선균에 부착된 기중균사, 영양균사, 포자의 형태, 가용성색소의 색깔 등을 조사하고 생리적 특성으로서는 멜라닌 색소의 생성, Protease, nitrate환원, cellulose효소활성을 조사한다.

  2.1.1 형태관찰

Yeast extract maltose agar(배지9), oatmeai agar(배지10), 무기염류 전분배지(배지16) 및 glycerol asparagine agar(배지11)에서 7, 14, 21일째에 관찰한다. 다수의 균을 취급하는 경우 여러 종류의 배지를 사용해야 하는 것은 번거로운 일이지만 배지가 상이함에 따라 형태의 일부가 달라지는 경우가 있으므로 수종의 배지를 사용하여 경시적으로 관찰한다.고배율로 관찰하려 할 때는 배지를 borer로 떼어내서 cover glass위에 얹고 방선균을 접종하여 무균적으로 Petri dish속에서 배양시킨 후 관찰하는 방법도 있다.

a) 포자병(Sporophore)의 형태

그림 6 - 1과 같이 8개의 그룹으로 나뉜다.

b) 포자의 표면구조 및 형태

포자의 형태, 크기 및 표면구조를 전자현미경으로 8,000∼10,000배율로 검경한다.

 

  2.1.2 방선균의 색

1) 기중균사의 색

2) 영양균사의 색 : 기중균사를 억제하고 colony를 면도칼로 절단해서 관찰한다.

3) 배지 중에 확산된 색소 : 차색 또는 흑색의 melanin색소를 제외하고 적, 황, 녹, 청, 자 색 등을 기재한다.

  2.1.3 방선균의 생리실험

방선균의 생리적성질 가운데 비교적 안정한 성질(melanin 색소생성, nitrate 환원능, protease 생성) 등은 분류의 기준이 되며 탄소화합물의 이용성도 조사할 필요가 있다.

1) Melanin색소의 생성

Pepton yeast extract agar(배지12), tyrosine agar(배지13)를 사용하여 28℃에서 4일간 배양 후 농갈색, 흑색의 색소성분을 조사한다.

2) Nitrate 환원

배지17을 이용하여 28℃에서 21일간 배양 후 sulfanilic acid 와 dimethyl-α-naphthyl amine 각 1㎖를 넣어 pink 또는 적색의 변화로 NO2- 를 검출한다.

3) Protease실험

Gelatin배지(배지14)를 이용하여 28℃에서 7, 14일째에 gelatin액화를 판정한다.

냉장고에 냉각시켜 둔 무 접종과 비교하여 3단계로 기재한다.

4) 탄소화합물의 이용성

탄소원이용성배지(배지15)를 살균하여 60℃로 냉각시키고 milipore filter로 살균한 탄소원(L-inositol과 cellulose의 경우는 alchol로 소독하거나 ethylen oxide로 살균)을 1% 혼합하여 평판을 만든 후 균주를 접종하여 16일째 생육도를 glucose를 사용하여 배양한 것과 비교하여

① glucose에서의 생육보다 좋은 것(+)

② glucose에서의 생육보다 나쁘나, 확실히 탄소원을 첨가하지 않은 경우보다 생육이 좋은 것(+)

③ 탄소원 무첨가보다 생육이 다소 좋은 것(+)

④ 탄소원 무첨가와 생육이 같은 것(-).

이상의 관찰항목을 기초로 각종 참고서와 대조하여 동정한다. 동일하게 배양하여 비교 대조되어야 한다.




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