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미생물이야기 세균을 동정하기 위하여 여러 종류의 특성을 조사하지 않으면 안되지만, 특성에 따라 다르게 할 필요가 있다.
2013-08-13 15:06:11
이엠생명과학연구원

1. 간이검사

세균을 동정하기 위하여 여러 종류의 특성을 조사하지 않으면 안되지만, 특성에 따라 다르게 할 필요가 있다.

즉, 유기영양세균은 세포의 형태와 그람염색성에 따라 속까지 분류하고 속은 생리적 성질에 따라 종까지 세분하는 것이 일반적이다. 한편 종을 분류하는 지표가 되는 생리적인 성질은 각각의 속에 따라 달라지기 때문에 우선 동정하기 적당한 균주가 형태적인 면에서 어떤 속에 속하는지 결정한 후 그 속을 종으로 분류하는 특징이 되는 성질을 조사하는 것이 좋다.

 

2. 동정 실험

 

2.1 세포형태의 관찰

 

2.1.1 세포형태

세포의 크기는 염색표본에 의해 조사하는 것이 보통이지만 동정할 때 크기가 축소되어 변형되기도 한다. 그러므로 nigrosine을 이용한 음염색(negative stain)이나 현적법(hanging drop)에 의하여 관찰을 하는 것이 좋다.

형태관찰은 액체배양보다 한천 사면배지와 같은 고체 배지에 배양된 세포를 가지고 행하는 것이 보통이다. 물론 액체배양에서의 형태를 동시에 관찰하기도 한다. 배양시간은 균의 생육속도에 따라 다르지만 일반적으로 관찰시에서 2일정도 배양하며, 배양온도는 생육 중의 관계에 따라 결정한다.

 

2.1.1.1 무침색표본에 의한 관찰

1) 현적법에 의한 세포관찰

hole slide glass의 오목한 부분의 양측에 소량의 바셀린을 바른다. 한편 깨끗한 cover glass의 중앙에 백금이를 넣고 소량의 살균수를 가하고 여기에 균체를 극소량으로 가한다.

그리고 균체가 묻은 부분을 아래로 하고 hole slide glass에 포갠 후 가볍게 눌러 바셀린과 밀착이 되게 한다.

현미경을 사용하여 800∼1,000배로 확대한다.

2)  음염색

slide glass에 증류수 1방울을 넣고 균체를 침전시킨다. 여기에 nigrosine액(1% 수용액)을 1백금이만큼 가하여 잘 혼합 한 후 풍건하여 검경한다. 회색 또는 담청색의 바탕에 세균세포가 하얗게 빠진 것처럼 보인다.

 

2.1.1.2 염색표본에 의한 관찰

① 도말

깨끗한 slide에 백금이로 소량의 멸균수를 취하고, 소량의 균체를 백금이로 멸균수와 가볍게 혼합하여 엷게 퍼지게 한다. 이 때 세균은 진하지 않은 것이 좋다.

② 건조

공기중에서 자연적으로 건조한다.

③ 고정

도말면을 위로 하고 gas버너 불꽃 가운데를 3회 정도 통과시킨다. 이러한 고정을 화염고정이라 한다.

④ 염색

일반적으로 Ziehl의 phenol fuchsin액, hucker의 crystal violet액 또는 그외 적당한 염색액을 이용하여, 염색액을 표본에 주입한 후 1∼2분 방치한다.

⑤ 수세

가볍게 slide 뒤면부터 수돗물로 색소를 수세하여 대부분의 색소가 씻길 때까지 한다.

⑥ 건조

수세된 것을 자연건조시키며, 이때 slide를 약간 기울여 물이 흘러 떨어지게 하는 것이 좋다. 급하게 화염건조하는 것은 좋지 않다.

⑦ 검경

800∼1,000배로 검경한다.

Ziehi의 phenol fuchsin 액

제 1액

-

Basic fuchsin

0.3 g

Ethyl alcohol(95%)

10 ㎖

제 2액

-

Phenol, crystaline

5 g

Distilled water

95 ㎖

제 1액과 제 2액을 혼합한다.

 

2.1.2 운동성과 편모

운동성이 있는 세포는 일반적으로 적당한 온도보다 5∼10℃ 낮은 온도에서 배양할 때 운동성이 좋다.

세포운동관찰시 브라운 운동에 의해 움직이고 있는 세포를 편모에 의해 움직이고 있다고 오인하는 경우도 있다. 이러한 경우에는 세포의 현적액에 미량의 염화제이수은용액이나 그 밖의 살균수를 가한 후 관찰한다. 죽은 세포는 운동하지 않기 때문에 처리 후에도 운동하게 되면 브라운 운동을 하는 것이라 할 수 있다.

세포의 편모착생상태(flagellation)는 세균의 분류, 동정의 중요한 지표가 되므로 그 관찰은 신중하게 행해져야 한다. 편모 염색은 가장 좋은 운동을 하는 조건에서 배양된 세포를 이용하여 염색을 한 후 광학현비경이나 전자현미경으로 관찰한다. 염색은 단백질로 된 편모를 tannin산과 같은 매염제로 처리하고 편모의 주위에 여러 종류의 물질을 침착한 후 fuchsin과 같은 색소로 염색한다.

 

2.1.2.1 편모 염색

운동성이 가장 좋은 배양균을 선택한 후 slide glass에 1방울의 물을 떨어뜨린 다음 이것이 넓게 퍼지면 백금이의 끝에 균체를 묻혀 물에 점적을 하는 방법으로 가볍게 소량의 균체를 가한다. 이렇게 하면 세균 자체의 운동성과 물의 건조에 의하여 넓게 퍼진다. 그러면 이것을 이용, 풍건하여 염색한다.

염색법에는 호전, Walc - pokrzywnicki 및 창원법 등이 있으며 여기서는 호전법을 소개하고자 한다.

편모염색 용액

제 1액

-

포화 명반액

2㎖

5% phenol

5㎖

20% Tannic acid

2㎖

제 2액

-

      Fuchsin 원액
(fuchsin 11g + ethyl alcohol 100㎖)

1㎖
제 1액 9㎖와 제 2액 1㎖를 사용전에 혼합하여 여과한다.

- 염색 순서 -

① 표본 수 매를 동시에 공기중에서 건조시킨다.

② 여과된 염색액을 모든 표본에 입힌다.

③ 그 후 30초, 1분, 1분 30초, 2분에 걸쳐 염색하고 조심스럽게 수세한다.

④ 건조된 것을 검경한다.

 

  2.1.3 포자염색

세포의 포자염색에는 많은 방법이 있지만 여기서는 가열이 필요한 Dorner법과 가열이 필요하지 않은 Bartholomew와 Mittwer의 방법을 기술한다.

< Dorner법 >

① 수 방울의 증류수가 들어있는 시험관에 균체를 현탁하여 농후한 액을 만든다.

② 이 균액에 동량의 Ziehl의 Phenol fuchsin을 가하여 잘 혼합한다. 비등하고 있는 탕욕중에 시험관을 넣고 10분간 또는 그 이상 가열한다.

③ 가열염색된 1 방울을 Slide에 취하고 1 백금이의 1% nigrosine 수용액과 잘 혼합하고 난 후 신속하게 넓게 퍼지게 한다.

④ 풍건하여 검경한다.

이렇게 염색하면, 바탕은 nigrosine에 의해 회색 또는 담청색이 된다. 생균포는 그 가운데가 하얗게 빠진 것처럼 보이고, 포자는 적색으로 염색된다.

< Bartholomew와 Mittwer에 의하나 Wirtz 방법 >

① 표본을 화염고정한다.

② 포화 malachite green 수용액(약 7.6%)으로 10분간 염색(가열하지 않는다.)

③ 10초간 수세

④ 0.25% safranine으로 10초간 염색

⑤ 수세, 건조, 검경

이 염색에 의해 포자는 녹색, 생균포는 적색으로 염색된다.




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