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미생물이야기 Gram염색은 세균의 분류, 동정에 있어 중요한 성질이다.
2013-08-13 15:07:42
이엠생명과학연구원

Gram 염색

Gram염색은 세균의 분류, 동정에 있어 중요한 성질이다. 그러나 모든 세균이 Gram 양성과 음성으로 뚜렷히 구별되는 것은 아니다. 어떤 것은 Gram 부정(Gram variable)이 되는 것도 있다. 이것은 조건에 따라 양성이 되었다 음성이 되는 것이다. Gram 부정을 확인하기 위하여 배지나 배양조건을 변화시켜 검토할 필요가 있다.

또한 배양의 경과에 의해 염색성이 음성으로부터 양성이 되거나 양성으로부터 음성이 되는 것이 있다. 이런 것은 Gram 부정이라고 하지 않고 주로 Gram 양성(prevailing positive) 또는 주로 Gram 음성(prevailing nagative)이라고 하고, 그 변화가 일어나는 조건을 기록한다.

Gram 부정의 세균의 경우 염색이 균일하지 않고 세포내에 탈색이 되지 않는 것이 계속 보일 때에는 Gram 부정이라고 기록하지 않고, 그 사실을 상세히 기록하고 ‘염색성이 일정하지 않다. Staining unevenly’ 라고 기록하는 것도 있다. 또한 Gram 음성세균 중에서도 염색의 정도에 따라 srtongly positive 또는 weakly positive라고 기재하기도 한다.

Gram 염색은 염색초기의 세포를 관찰하는 것이 보통이지만 성숙한 포자, 사균포는 Gram 음성이 되기 때문에 이것을 혼재하는 경우 이를 Gram 부정이라고 할 수 있기 때문에 주의할 필요가 있다.

그러므로 1매의 슬라이드에서 동정할 필요가 있는 균주와 Gram 양성균(staphylococcus aureus)과 Gram 음성균(Escherichia coli)을 간격을 두고 동시에 염색하여 Gram 염색성을 관찰하는 것이 편리하다.

그리고 광학현미경의 광원에 텅스텐구를 사용하면 색 온도의 관계에 의하여 염색성을 판정하기 어렵기 때문에 반드시 청색필터를 갈아끼우고 검경한다.

 

< Gram 염색 : Hucker 법 >

Hucker 염색액

제1액 : Crystal violet 액

A 액

--

Crystal violet

2 g

Ethyl alcohol(95%)

20㎖

B 액

--

Ammonium oxalate

0.8 g

Distilled water

80㎖
A 액과 B 액을 혼합하여 살균한다.

제 2액 : Lugol’s 액

Iodine

1 g

Potassium iodide

2 g

Distilled water

300㎖

Potassium iodide를 소량의 증류수에 녹인 후 Iodine를 가해서 잘 녹인 다음 나머지 증류수를 가한다.

제 3 액 : Safranine 액(2.5%)

0.25g의 Safranine을 10㎖의 95% ethanol에 녹인 다음 증류수로 100㎖가 되게 한다.

 

- 염색방법 -

① 도말, 풍건, 고정한다.

② 제 1액에 1분간 염색

③ 수세 후 제 2액에 1분간 담근다.

④ 수세 후 도말면을 완전히 건조시키면 좋은 결과를 얻지 못한다.

⑤ 95% ethanol 중에서 slide glass를 천천히 움직이며 탈색한 후 수세한다.

⑥ 제 3액에서 1분간 대비염색한다.

⑦ 수세한 후 건조시켜 검경한다.

⑴ 도말표본을 만들 때 세균농도가 진하거나 희박하여도 좋은 결과를 얻지 못한다.

⑵ Ethanol로 탈색할 때 계속해서 담가두면 Gram 양성균도 탈색해버리므로 미리 Gram 염색성을 알 수 있는 균주로 여러 번 염색하는 것이 좋다.

⑶ 염색은 시계를 보며 정확히 행하는 것이 요망된다.




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