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미생물이야기 혐기성 세균의 동정시 속을 분류하는 기준은 형태, Gram염색성, 발효생산물 등이다.
2013-08-13 15:11:37
이엠생명과학연구원

혐기성 세균

 

혐기성 세균의 동정시 속을 분류하는 기준은 형태, Gram염색성, 발효생산물 등이다.

이들 세균은 분자형 산소를 이용하지 않고, 에너지대사결과 어느 정도의 유기물을 남기기 때문에 이 물질의 동정 또는 정량이 군별분류에 이용된다. 이러한 점은 혐기성세균 군별분류에 따른 당의 이용형식(산화 또는 발효)으로 중요시 되고 있다.

 

 

 

1. 배지

혐기성 세균을 계수, 분리하는데 사용되는 배지는 beef-extract 한천배지, PY배지, VL배지, albumin배지 등이 있다.

또한 특수한 기능을 갖는 혐기성세균을 분리하는데는 황산환원균 분리배지, 질소고정균 분리배지와 cellulose분해균 분리배지 등이 이용된다.

 

2. 생균수 계수와 혐기성 배양법

① 토양시료를 건토로서 약 1g취한다.

② 시료를 auto-clave 멸균(120℃, 15분)된 희석액100㎖가 들어 있는 삼각플라스크에 넣고 격렬하게 교반한다.

③ 교반 후 현탁액 1㎖를 9㎖의 희석액에 순차적으로 넣어 잘 교반하며 각각의 희석단계별 현탁액을 만든다.

④ 이 토양희석현탁액을 Petri-dish에 피펫으로 넣고 한천배지를 부어 굳힌 후 혐기적으로 배양한다. 30℃에서 10∼14일간 배양한 뒤 배지에 생육한 colony를 계수한다.

⑤ 이 조작을 할 때는 단시간내에 처리하며 혐기성 세균이 공기에 접촉하는 시간을 짧게 한다.

⑥ 이상의 방법은 토양 중의 세균을 분리하는 일반적인 방법이지만 편성혐기성세균(편성혐기성세균)을 분리할 때는 혐기상태하에서 희석하는 것이 좋다.

혐기성세균의 배양법으로는 공기중의 산소를 제거하는 방법이나 질소, 수소, 이산화탄소 등으로 공기를 치환하는 방법 등이 있다.

다음은 이들 배양법 중에서 토양미생물의 연구에 널리 쓰이는 방법을 기술키로 한다.

- 희   석   액 -

시 약 첨 가 량
NaCl 0.9 g
KCl 0.042 g
CaCl2.6H2O 0.048 g
NaHCO3 0.02 g
Cysteine.HCl 0.2 g
Distilled water 400 ㎖

 

2.1 Roll tube법

목적하는 혐기성 세균을 분리하는데 적합한 배지에 한천 1.5% 와 resazurin 0.0001%(W/V)를 가한다. 배지를 멸균한 다음 한천이 굳지 않는 온도로 보존된 배지에 산소를 제거한 질소가스 혹은 탄산가스 등을 불어넣는다.

이 때 resazurin의 적색이 없어지면 배지는 환원상태로 된 것이다.

- Roll tube제작과 균의 계수 -

적당히 희석된 시료 1㎖를 시험관에 넣는다(시험관은 질소가스분사관을 사용하여 공기를 치환하는 것이 좋다.). 즉 가스를 불어넣으면서 멸균된 배지 9㎖를 피펫 및 분주용 기구를 사용하여 무균적으로 넣는다.

배지를 분주한 후 멸균된 butyl고무마개를 하고 한천이 시험관의 기면에 얇은 피막상태로 굳게 시험관을 수평으로 놓고 회전시켜 배지를 굳힌 다음 30℃에서 10∼14일간 배양 후 colony를 계수 및 분리한다.

이 Roll tube법을 미국에서는 PRAS(Pre-Reduction Anaerobically Sterillized)라고 한다.

 

2.2 Rosental법

금속 크롬과 황산을 반응시키면 용기내의 산소가 제거되고 수소가스가 발생하는 것을 이용하는 것이다.

금속크롬을 잘게 마쇄하여 유리그릇(데시케이터 용량 5ℓ중 크롬이 약 5 g정도)에 넣고, 여기에 15% 황산을 크롬 5g에 대해 약 150∼200㎖가 되게 주입한다.

시료와 한천배지를 넣어 굳힌 페트리 접시와 혐기도지시약(indicator)가 담긴 시험관과 황산크롬이 담긴 용기를 데시케이터에 넣고 밀봉한 후 진공펌프로 데시케이터 내의 공기를 제거한다.

데시케이터 내의 공기가 감소하면 크롬과 황산이 반응하여 수소가스를 발생시키는데 진공조작시간은 20∼30분이면 충분하다. 이것을 30℃에서 10∼14분간 배양한 후 colony를 계수,분리한다.

- 혐기지시약(indicator) 제조 -

첨가 시약

① 6% glucose수용액

② 0.1N NaOH 6㎖를 증류수 100㎖에 희석

③ 0.5% methene blue 3㎖를 증류수100㎖로 희석

위 세가지 용액을 동량혼합한 후 시험관에 지시약을 넣고 끓여 청색에서 무색이 되기 직전에 데시케이터 내에 넣는다.

배양기가 혐기상태이면 무색이지만 산화되면 청색을 나타낸다.

 

2.3 Rosenthal 개량법

Roeanthal법에서의 순수한 금속크롬대신에 Cr3+를 아연(Zn)으로 환원하는 것이다.

- 조작 -

a. 과립금석아연(3.3g/진공데시케이터 1ℓ)

b. 탄산칼슘 (0.23g/진공데시케이터1ℓ)

c. CrK(SO4)2 100g을 증류수에 녹이고 진한 황산 120㎖를 가한다. 이 용액은 진공데시케이터 1ℓ당 20㎖를 사용한다.

유리병에 a, b, c를 차례대로 가한 뒤 데시케이터에 넣고 진공조작을 한다.

- 지시약 -

(1) 0.2M Phosphate buffer solution

(The final concentration of indicator is 0.04% in buffer)

(2) Ascorbic acid 0.5%(W/V)

(3) Agar 0.6%(W/V)

………… 1㎖

 

………… 1㎖

………… 8㎖

뜨거운 한천용액(3) 8㎖를 시험관에 넣고 지시약 (1)과 (2)를 가한 뒤 방냉한다. Gel상으로 굳은 용액을 배양기에 넣고 사용한다. 산화되면 청색이 나타날 때까지 열을 가해 환원상태로 한 후 사용한다.

 

2.4 Steel wool법

- 재료 -

Steel wool(10g/3ℓ desicator)

95 ㎖

Activation solution

 

CuSO4.5H2O

2.5∼5 g

Tween 80

2.5 g

Distilled water

1,000 ℓ

PH1.5∼2.0 (1N H2SO4)

 

- 조작 -

Steel wood(시중의 철수세미) 10g을 황산동용액 500㎖에 담근다. 용액이 어두운 회색이 되어 용액의 동색이 없어질 때까지 충분히 담가둔다. 이렇게 하면 steel은 적동색이 된다.

일반적으로 혐기성세균의 생육은 탄산가스가 있을 때 양호하므로 탄산마그네슘과 NaHCO3를 동량혼합하여 5g을 비이커에 넣고 물 10∼15㎖를 넣어 CO2를 발생시키는 것이 좋다.

지시약은 Rosenthal법에서 사용된 것을 이용하며 진공펌프로 데시케이터 내의 공기를 제거한 후 30℃ 항온실에서 10∼14일간 배양한 후 생육된 콜로니를 계수 또는 분리한다.

 

3. Clostridium의 계수

Clostridium은 광범위하게 토양에 분포하며, 포자를 형성하는 혐기성세균의 일종이다. 균종에 따라 세포의 중앙에 포자를 형성하는 것( Clostridium type)과 세포말단에 형성하는 것 (Plectridium type)으로 분류되며 이들의 포자는 내열성이 있다.

- 조작 -

① 토양희석 현탁액을 만들어 PY한천배지 또는Clostridium 선택배지에 접종한 후 30℃에서 10∼14일간 혐기배양한다.

② 적당한 수의 colony가 형성된 페트리접시로부터 모든 colony를 백금선으로 떼어내어 사 면배지에 이식하여 혐기배양한다.

③ 사면배지에서 VL배지로 이식하여 30℃에서 4일간 배양한다.

④ 이 배양액 1백금이를 취하여 멸균수가 들어있는 시험관에 옮긴다.

⑤ 이 시험관을 80℃ water bath에서 10분간 넣어둔다.

⑥ 열처리 후 수돗물로 냉각한 후 백금이를 사용하여 배지에 접종한다.

⑦ 이를 30℃에서 4일간 혐기배양한다. 이 때 생육된 균주는 포자형성균이다.

⑧ 포자형성균으로 판정된 균의 사면배지에 3% 과산화수소를 주입하여 catalase시험을 한다. 이 때 가스가 발생하지 않는 것이 catalase 음성이며 이와 같이 판정된 catalase 음성균과 포자형성 여부시험에서 형성균으로 판정된 균이 Clostridium 이다.

 

4. 분리법

호기성 세균의 경우에 잘 사용되는 평판희석법에 시험관을 이용하는 것이다. 즉 혐기성상태하에서 처리한 roll-tube법에 의해 tube상에 나타난 colony를 탄산가스기류하에서 떼어내어 별도로 준비된 사면한천배지에 이식하여 분리한다.

분리 후 호기성조건에서의 생육 유무를 반드시 검사하여야 한다.




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