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미생물이야기 세균의 성상검사는 앞에서 언급한 기본배지에 여러 종류의 물질을 가하여 실시한다.
2013-08-13 15:15:21
이엠생명과학연구원

성상검사

세균의 성상검사는 앞에서 언급한 기본배지에 여러 종류의 물질을 가하여 실시한다. 검사항목, 검출방법의 원칙은 호기성 세균과 크게 다르지 않다.

혐기성 세균의 에너지대사결과 배지 중에 남아있는 여러 유기물 등의 성분에 따라 세균이 분류되므로 유기물 분석이 혐기성 세균 분류에 있어 매우 중요하다.

1. 유기물 분석

혐기성세균의 주요한 생산물은 저급 지방산, 유산, succinic acid, 저급 알코올 등이다. 이들 물질들은 가스 크로마토그래피에 의해서 쉽게 정성 및 정량분석할 수 있다.

 

2. 생리검사

 

2.1 혐기도 검사

PY배지에 0.2% glucose와 0.2% 한천을 가한 배지를 사용한다

이 반고체 배지에 백금선으로 배지의 표면부터 시험관 밑부분까지 찔러 접종한다. 30℃에서 배양하여 생육상을 조사한다. 배지표면부터 밑부분 전체에 걸쳐 생육하는 세균은 통성 혐기세균(facultataive anaerobe), 배지 표면 근처에서만 생육하는 미호기성세균(microaerobic bacteria), 아래 부분에서만 생육하는 편성 혐기성세균(strict anaerobic)으로 구별한다.

이 실험을 할 때에는 배지를 신속히 냉각시켜 산화가 되지 않게 하며, 지시약으로 0.0001% resazurin 지시약을 사용한다.

  2.2 당류-자화시험

PY배지에 시험하는 당을 0.5%, 한천을 0.2%가 되게 가하고 0.2% BTB 수용액(12㎖/1ℓ배지)을 가한 배지를 사용한다.

고층한천배지에 백금선으로 공시균주를 접종하여 30℃에서 4일간 배양한다.

경시적으로 가스생성, 당의 생성을 관찰한다. 가스는 기포로 반고체 배지 가운데서 생성된다. 산의 생성은 BTB가 청색에서 황색으로 변하는 유무를 판단하여 자화성을 판단한다.

  2.3 Milk응고 및 소화시험

탈지우유(skim milk )180g, cysteine.HCl 0.8g을 증류수 1000㎖에 녹인다. pH를 7.2∼7.4로 조정한 다음 Auto-clave로 멸균(110℃, 20분)한 후 공시균주를 접종하여 경시적으로 milk의 응고 및 소화를 관찰한다.

  2.4 Gelatin의 소화

PY배지에 glucose 0.2%, gelatine 12%가 되게 가한 후 110℃, 15분간 auto-clave에서 멸균한다.

Gelatin 배지에 공시균주를 접종한 뒤 혐기배양한다. 30℃에서 7일간 배양한 뒤, 수돗물로 30분간 냉각시킬 때 고화되지 않고 액화될 때 gelatin 액화능이 양성이다.

  2.5 황산수소생성

0.2% PY한천배지 1000㎖에 황산제1철 0.2g, 티오황산나트륨 0.3g을 가한 배지를 사용한다.

auto-calve로 120℃, 10분간 멸균한 후 배지에 공시균주를 접종한 뒤 30℃에서 4일간 배양한다. 황화수소가 생성되면 배지가 흑색으로 변한다.

  2.6 질산염 환원

PY배지에 0.2% glucose, 0.5% 질산나트륨, 0.2% 한천을 가한 배지를 이용하며, 110℃, 15분간 Auto-clave에서 멸균한다. 배지에 공시균주를 접종하여 30℃에서 4일간 배양한다.

아질산 검출은 0.8% sulfanilic acid의 5N초산용액, 0.5% α-나프틸아민의 5% 초산용액을 차례대로 가한다. 용액 내에 아질산이 존재하면 적색으로 나타난다.

 2.7 Indole 생성

PY배지에 0.2% 한천을 가한 배지를 사용한다. 120℃, 10분간 auto-clave에서 멸균한 후 공시균주를 접종한 후 30℃에서 4일간 배양한다.

Indole 검출은 Kovac시약을 이용하며 Indole이 생성되면 적색이 나타난다.

Kovac시약은 호기성 세균의 Indole생성시험을 참조한다.

2.8 Catalase 시험

PY배지에 0.2% glucose, 2% 한천을 가한 사면배지를 이용한다.

110℃, 15분간 auto-clave 에서 멸균하여 배지에 공시균주를 접종하고 30℃에서 4일간 혐기적으로 배양한다.

검정법은 호기성균배양법을 참조한다.

2.9 헤모라이신 시험

- 배지 -

Beef extraction

1 g
Peptone 5 g
Yeast extract 2 g
NaCl 5 g
Blood 500 ml
Agar 15 g
Distilled water 1,000 ml

혈액을 제외한 성분을 가온, 용해시킨 후 pH를 7.2로 수정하고 Auto-clave 멸균한다. 배지를 50∼55℃로 보전하고, 무균적으로 혈액을 가한다. 혈액은 멸균된 말 혈액을 이용한다.

무균적으로 배지를 페트리 접시에 넣고 고화시킨 후 배지 표면에 세균을 도말배양한다. 헤모라이신을 함유하면 colony주위의 혈구가 용해된다.

2.10 Acetone, Aldehyde, Alcohol검출

PY배지에 0.5% glucose를 포함시킨 배지를 이용한다. 110℃, 10분간 auto-clave에서 멸균한다.

200㎖의 배지에 공시균주를 접종하고 30℃에서 4일간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한다. 상등액 100㎖를 1N NaOH를 사용하여 약 알칼리성으로 한 후 증류수 20㎖를 가하여 증류시켜 유액 100㎖를 받는다.

 

(1) Acetone 검출

유액 5∼10㎖를 시험관에 취하고 유안결정을 가해 포화시킨다. 여기에 새로 제조한 sodium nitrprusside (5% 수용액) 2∼3방울과 진한 암모니아수 1∼2㎖를 첨가하여 20분 후에 자색이 나타나면 양성이다.

(2) Aldehyde검출

유액에 암모니아성 질산은용액을 가한다. 알데히드를 함유하면 환원되어 흑색으로 혼탁해지거나, 침전 또는 은경을 생성한다.

- 암모니아성 질산은 용액 -

AgNO3

10 g
Ammonium water 3㎖
NaOH(10%) 30 ㎖

(3) Alcohol검출

유액 1㎖에 몰리브덴산 황산액 2∼3㎖를 가하고 가열한다. ethanol을 함유하면 청색을 나타낸다. 몰리브덴산 황산액은 몰리브덴산을 진한 황산에 녹인다.

  2.11 휘발성 지방산의 생성

PY배지에 0.5% glucose를 가한 배지를 이용하여 110℃에서 15분간 auto-clave멸균한다.

배지에 공시균주를 접종하고 30℃에서 4일간 배양한다.

배양액 5㎖에 대해 m-phosphoric acid(5N 황산에 25%가 되게 희석) 1㎖를 가하고 30분이 지나면 원심분리하여 상등액을 gas chromatography로 분석한다.

  2.12 비휘발성균의 생성

유기산을 methyl ester화 하여 gas chromatography로 분석한다. 휘발성유기산과 마찬가지로 메타 인산처리된 상등액을 사용한다.

소형시험관에 상등액 1㎖를 취하고 실린더형 진공 데시케이터에 넣고 동결건조한다. 건조 후 즉시 불화붕소, 메탄올용액 0.1㎖를 가하여 100℃ 끊는 물에서 4분간 가온시킨다. 가온 후 수돗물로 30초간 냉각한다.

냉각 후 클로로포름.메탄올(14:1)용액0.5㎖를 가한 후 ester화 된 유기산의 분리를 위해 진탕한다. 진탕 후 NaOH 0.1㎖를 가하고 다시 재진탕한다. 상층의 클로로포름층을 가스 크로마토그래피로 분석한다.




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