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미생물이야기 Azotobacter는 질소고정력이 있으므로 무질소배지를 이용하여 생육시킨다.
2013-08-13 16:08:01
이엠생명과학연구원

1.단생 질소 고정균

 

1.1 Azotobacter

 

1.1.1 계수

Azotobacter는 질소고정력이 있으므로 무질소배지를 이용하여 생육시킨다. 질소고정력이 없는 균종은 무질소배지에서 생육하지 않으므로 계수측정이 용이하다. 희석평판법으로 1∼2주가 배양한다.(매우 작은 콜로니는 비질소고정균인 경우가 많다.) 그러나 이때 계수된 콜로니 가운데는 Azotobacter이외의 질소고정균이 존재한다고 보고되고 있으므로 다음에 기술하는 분리법으로 Azotobacter로서의 특징을 조사한 다음 계수치를 확인할 필요가 있다.

  1.1.2 분리

토양시료 1g(또는 시료액 20mℓ)정도를 Azotobacter 무질소기초배지 100 mℓ에 첨가하여 25∼30℃ 암실에서 진탕배양시켜 이것을 다시 직접 배양한다. 정치배양하면 표면에 피막을 형성하여 세포가 서로 부착되어 콜로니를 분리할 수 없다.

최초의 배양기 중에는 비질소고정의 유기영양미생물이 섞여 있으므로 이식과 진탕배양을 수회 반복한 후 평판법으로 콜로니를 형성시킨다. 배양 후 오랫동안 방치하면, 질소를 고정하여 증식된 균체에서 분비하는 물질을 이용하여 생육하는 비질소고정균이 생육되기도 하므로 분리배양을 하여 질소고정균의 대수증식기 후반까지의 것을 차례로 이식하여 최종적으로 희석평판법에 의해 분리한다.

A. chroococum의 생육을 선택적으로 촉진할 경우에는 전분을 1%, A. vinelandii의 생육촉진에는 rhamnose를 사용한다. A. beijerinkia , A. maerocytogenes를 선택할 경우에는 sucrose를 가한 후 pH 5.0∼6.0으로 하여 배양시키는 것이 좋다.

표 1.  Azotobacter종의 특징

균종 세포크기 Microyst 형성 편모 색               소 서식처
비수용성 수용성 형광색

A.agillis

3∼5

-

주변

-

녹색

청백색

A.insingnis

3∼5

-

극성

연갈색

녹색

-

A.vinelandii

2.4¡0.5

+

주변

-

녹색

황녹색

물,토양

A.macrocytogenes

2

-

극성

-

자색

N.R

토양

A.chroococcum

2.4×0.5

+

주변

갈색

-

-

물,토양

A.beijerinkia

2.4¡7.6

+

비운동성

연갈색

-

-

물,토양

 

1.2 질소고정성 Clostrodoum 계수와 분리

  1.2.1 계수

Clostrodoum 중 비질소고정성인 것은 병원성이 있는 것을 포함하여 그리 많지 않은 종이 보고되고 있으나, 질소고정능이 있는 것은 다음 표와 같이 그다지 많지 않다.

질소고정성 Clostrodoum의 배양액을 사용하여 N2가스를 포함한 혐기상태에서 희석평판법이나 희석빈도법 등으로 쉽게 계수한다. 배양법은 혐기배양법에 준한다.

표 2  질소고정성 Clostridium

C. butyricum

C. acetobutylicum

C. lactoacetophilum

C. pectinovorum

C. beijerinckii

C. kluyveri

C. tetanomorphum

C. pasteurianum

C. madisonii

C. felsineum

 

  1.2.2 분리

토양(약1∼5g) 또는 시료용액(1∼5mℓ)를 무질소배지 약 50mℓ(200∼300 mℓ 삼각플라스크)에 넣고 산소를 완전히 제거하고 질소로 치환한다. 30℃ 전후로 배양을 하며 이식을 여러 차례 반복하여 질소고정성 Clostrodoum을 영양배양한다.

다음에 혐기상태하에서 한천배지법으로 콜로니를 분리하여 여러 차례 반복 순수분리한다.

 

1.3 질소고정성 남조의 계수와 분리

질소고정성 남조는 생물계에서 두 가지의 중요한 동화작용을 하는데, 광합성 작용과 질소고정작용이다.

표 8 - 4 질소고정성 남조류

 

공 생 하 는 생 물 속 명

남 조 속 명

사상균(지의류)

Ascomycetes(자낭균)

Basidiomycetes(담자균)

Fungi imperfecti(불완전균)

Phycomycetes(조균)

Calothrix, Chroococcus

Dichothrix, Gloeocapsa, Hyella, Nostoc

Scytonema, Stigonema

Nostoc

선 태 류

Anthoceros

Blasia

Cavicularia

Nostoc, Anabaena

양 치 류

Azolla(물개구리 밥)

Anabaena axollae

나 자 식 물

Bowenia, Ceratozamia

Cycas(소철), Dioon

Encephalartos, Macrozamia

Stangeria, Zamia

Nostoc, Anabaena

피 자 식 물

Gunnera

Nostoc punctiforme

위의 표는 일반적으로 계수.분리되는 남조와 공생하는 식물을 나타낸 것이다.

  1.3.1 배양액

모든 남조류에 맞는 배양액을 없으므로 각각 대상으로 하는 남조류에 적합한 배양액을 사용한다.

  1.3.2 계수

남조에는 사상의 군체가 되거나, pectin 모양의 물질을 분비하여 덩어리형태나 막의 형태로 되는 것이 있으므로 시료를 homogenizer로 분산균일화한 후 접종할 필요가 있다. 토양시료 1g 혹은 시료용액 1㎖를 남조무질소배지 8㎖에 첨가하고, 여러 단계의 농도로 희석하여 희석빈도법이나 희석평판법으로 세포수를 계수한다.

  1.3.3 분리

시료토양 수 g 또는 시료용액 수 ㎖를 남조 무질소배지 5㎖에 첨가하여, 조명조건하에서 약간 통기배양하면, 3주∼2개월 후에는 질소고정성 남조류가 생육한다. 최초의 배양에는 비질소고정 조류도 공존하므로 여러 차례 집적 배양을 반복한다.

남조류 주변에는 점성물질이 있어 보통 그 중간에 각 종의 유기영양미생물이 공존하게 되므로 이것을 제거할 필요가 있다.

이 때는 배양액을 교반시키면서 자외선을 수 시간 또는 수 일간 조사한 후(20W 자외선등을 약 25∼35cm 정도의 거리에서 조사), 새로운 살균배지에 접종하면 유기영양성잡균이 사멸된다. 또는 수백 ppm 또는 수천 ppm농도의 항생물질 - 예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등 - 에 수 십분 내지는 수 시간 넣어두면 잡균이 사멸되기도 한다. 잡균제거 처리 후 잡균의 존재 유무를 유기영양세균용배지에 접종하여 판정한다. (잡균중에는 질소고정능을 가지고 있는 유기영양세균도 있으므로 무질소영양배지도 시험할 필요가 있다.)

이러한 방법으로 잡균이 제거되어 순수분리가 된 남조 세포은 일시적으로 질소고정성이 강해지거나 생육이 매우 불량하게 되므로, 남조 무질소배지에 질산암모늄(미량 0.5g/ℓ정도)혹은 그 밖의 화합태질소를 첨가하여 배양한 후 희석평판법(광조명조작하)이나 사주평판법(광조명조작하)으로 질소고정성 남조를 순수분리하여 동정한다.




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