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미생물이야기 근류균을 분리하는 방법은 크게 토양에서 직접 분리하는 법과 근류로부터 분리하는 방법으로 나눌 수 있다.
2013-08-13 16:09:03
이엠생명과학연구원

공생질소고정 근류균

근류균을 분리하는 방법은 크게 토양에서 직접 분리하는 법과 근류로부터 분리하는 방법으로 나눌 수 있다.

토양에서 근류균을 직접 분리하는 방법으로는 많은 선택배지가 사용되고 있지만 평판배지상에서는 토양중에 서식하고 있는 비슷한 균과의 구별이 어렵다. 근류에서 분리하는 방법에는 토양 또는 토양 희석액을 두과식물의 종자에 접종하여 근류를 착생시켜 분리하는 법과 자생 또는 재배되고 있는 두과식물에서 근류를 채취하여 근류균을 분리하는 방법이 있다. 여기서는 근류에서 분리하는 방법에 대하여 설명하고자 한다.

1. 근류채취

근류채취시기는 봄부터 초여름까지가 가장 적당하다. 그 이유는 근류는 지상부가 개화기를 지나면 파괴되어 근류중의 근류균이 다시 토양으로 환원되기 때문에 그 이전 또는 질소고정이 왕성한 시기에 신선한 근류를 채취한다.

근류의 표면에는 토양입자 뿐만 아니라 많은 잡균이 부착되어 있으므로 우선 근류를 깨끗이 물로 씻어내어 토양입자를 제거한다. 근류표면이 약하거나 작은 것은 어느 정도 물로 씻은 다음 소형용기에 넣고 용기의 1/3 정도가 되게 물을 넣고 용기를 가볍게 진탕시키며 용기내에서 수회 반복 세척한다. 근류가 작은 경우에는 세척에 이용된 용기 그대로 근류를 넣고 살균액(0.1%, HgCl2)을 일간 용기의 최상부까지 가하여 용기내를 살균한다. 1∼2분 후 승홍수 1/3정도를 남겨놓고 버린 후 3∼4분간 살균한다. 그러나 아카시아 등의 수목의 근류는 표면이 강하고 크므로 살균시간을 5∼7분까지 연장하거나 물 1ℓ에 승홍 1g과 진한 염산 5 ㎖를 가해서 살균액으로 하여 4∼5분간 살균한다.

근류표면의 살균이 끝나면 승홍수를 별도의 용기에 따르고 살균수로 용기 내부와 근류표면에 승홍수가 남아 있지 않게 세척한다. 세척은 살균수를 가해 잘 진탕하여 세척하는 과정을 4∼6회 반복한다.

2. 근류의 마쇄

근류가 작은 경우에는 살균에 사용된 용기를 그대로 이용하여 근류의 2∼3배의 살균수를 가하여 (1∼3㎖), 선단에 둥근 유리막대(3∼5mm두께)로 붉은색(leg - hemoglobin)이 나타날 때까지 마쇄한다. 한편, 근류가 크거나 단단한 경우에는 살균된 소형유침(내경 40∼50mm)을 이용하여 유봉으로 마쇄한다.

3. 근류균의 분리

마쇄액을 일반 세균분리조작에 준하여 백금이를 이용하여 평판법으로 한다. 이 때 사용되는 배지는 yeast extract mannitol배지이다. 평판배지에 이식한 후 27∼28℃로 배양하여 콜로니를 형성시킨다. 콜로니는 생육이 빠른 것은 2∼3일, 늦는 것은 5∼6일경에 형성된다.

콜로니가 독립되어 나타나는 시기에 페트리접시 뒷면,콜로니 주위 및 내부의 성장을 저배율로 검경하며, 단세포에서 생육된 정상적인 독립콜로니를 yeast - extract mannitol 사면배지에 이식한다.사면배지에 이식한 후, 생육속도, 콜로니특징 등을 관찰, 기록한다. 콜로니가 비정상적일 때는 다시 한번 근류균부유액을 만들어 희석평판법 또는 이복평판법을 반복하여 완전한 순수균을 분리한다.

표 1.  근류균 및 평판상의 콜로니의 일반적인 특성

식물군명

근 류 균

숙 주 식 물

콜 리 니 특 성

알팔파

R. meliloti

Medicago

Melilotus

원형, 백색 또는 무색투명∼반투명, 습윤한 파라핀상 이슬방울처럼 돌기, 생육 늦음 5∼6일 28℃

콜로바

R. trifolii

Trifolium

원형, 백색반투명, 이슬방울처럼 돌기, 점성(실처럼 늘어남),  생육 빠름(2일)

완두

R. legumi nosarym

Vicia

Pisum

Lathyrus

원형, 백색반∼투명, 파라핀상 광택, 이슬모양돌기

점성이 크고 생육이 빠름(2일)

강낭콩

R. phaseoli

Phaseolus

Vulgaris

완두, 클로바군과 흡사

루핀

R. lupini

Lupinus

Ornithopus

원형, 백색불투명, 약간 습성이며 파라핀상 광택

생육이 늦음(6∼7일)

대두

R. japolicum

Glycine

루핀군과 유사한 균주와 반투명으로서 생육이 약간 빠른 균주가 있다.

Cowpea

R. sp.

Arachis

Canavalia

Vigna

Lespedeza

Phaselus

Angularis

루핀과 대두군과 흡사

자운영

R. sp.

Astragalus

Sinicus

원형, 대부분의 균주는 투명, 습성

물방울상, 생육은 3∼4일

 

 

4. 근류균 확인 및 동정

순수분리된 균의 근류균여부는 근류를 채취한 식물을 공시접종하여 근류형성유무를 확인한다. 이 때 인공배지상에서 세균학적인 성상의 검색을 행한다.




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