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미생물이야기 탈질균 및 탈산환원균
2013-08-13 16:10:08
이엠생명과학연구원

탈질균 및 탈산환원균의 계수

 

1. 질산염 beef extreact배지법

 

1.1 기구와 시약

1) 질산염 beef extract 배지

질산염 beef extract 배지(배지17)를 조제하여 토양시료 1점 당 25개의 시험관에 9㎖씩 분주하고 1기압에서 15분간 autoclave살균한다.

2) 유동 paraffin

삼각플라스크에 얇은 층상으로 넣어 160℃에서 1∼2시간 건열 살균한다.

3) 황산 diphenylamine용액

diphenylamine 1g을 진한 황산 100㎖에 용해시키고 이를 증류수 20㎖에 조심스럽게 희석하여 갈색병으로 보관한다. 보관 중에 착색하기 쉬우므로 사용직전에 만들어 쓴다.

4) 진한황산

 1.2 조작

조제한 토양희석현탁액(통상 10-2∼10-6) 1㎖씩을 각 희석단계별로 5개의 시험관에 접종한다. 시험관 중의 배지는 접종직전에 끊는 물에 15∼20분간 가열하여 용존산소를 제거한 후 냉각시켜 접종하고 살균된 피펫으로 유동 paraffin(약 4㎖)를 배지 위에 중층한다. 시험관을 28∼30℃로 9일간 배양하고 진한 황산 0.2∼0.5㎖와 황산 diphenylamine용액 0.2∼0.5㎖를 시험관 기벽을 따라 서서히 주입시킨다. 이 때 시험관에 존재하는 NO2- 나NO3-가 있으면 진한 남색으로 된다. 시험관을 진탕하면 발색이 불명확하게 되므로 주의해야 되며, 진한 남색으로 발색되는 것은 탈질작용이 일어나지 않은 것을 의미한다. 희석단계별로 무발색 시험관을 기록하여, MPN법으로 시료 중 세균수를 산출한다. 이 방법으로 계수되는 세균은 탈질세균과 NO3- 를 NH4+로 환원하는 질산환원균이 포함된다.

 

2.Giltay 배지법

  2.1 기구와 시약

Giltay배지(배지26)를 조제하여 직립관을 넣은 시험관에 10㎖씩 분주하고 1기압하에 15분간 autoclave살균한다.

 2.2 조작

토양현탁액(보통 10-2∼10-6)을 희석단계별로 1㎖씩 각각 5개의 시험관에 접종한다. 이 때 직립관에 기포가 생기면 안된다. 접종한 시험관을 30℃에서 10∼14일간 배양한다. 접종전 배지(pH 7.0∼7.2)는 BTB에 의해서 녹색으로 발색되나, 질산환원균에 의한 N03-의 소실이 없는 배지는 알칼리성으로 되어 진한 청색으로 된다. 탈질이 되면 배지가 변색되고 동시에 다량의 N2가스가 발생되어 직립관에 포집된다. 진한 청색은 질산환원균이 생육된 것을 의미하고 변색과 동시에 가스가 발생된 것은 탈질균이 생육된 것이다. 각 희석단계별로 이러한 시험관을 기록하여 MPN법으로 시료 중의 질산환원균 및 탈질균수를 산출한다.

 

3. 탈질세균의 분리

 3.1 기구와 시약

1) 토양침출액한천배지(배지22) 또는 albumin한천배지(배지1)

2) 질산염 beef extract배지(배지17)

3) Giltay배지(배지26)

 3.2 조작

배지(배지 1 또는 22)를 이용하여 순수분리한 균주를 시험관 중의 배지 10㎖에 접종하고 30℃에서 24∼28시간 배양한다. 배양된 것을 살균수로 100배 희석하고 0.1㎖씩 배지에 접종한다. 30℃에서 배양하여 진한 청색으로 변화되고 동시에 활발하게 기포를 생성한 균주가 탈질균이다.

 

4. 유황세균의 계수와 분리

자연환경에서 유황의 순환에 관여하는 비생물은 다음과 같은 생리적 특성을 갖는 유황세균들로 구분되고 있다.

1군) 무기유황화합물을 산화하여 균체 내에 유황입자를 침적하는 화학합성세균

2군) 무기유황화합물을 산화해서 균체 외에 유황입자를 침적하는 화학합성세균

3군) 유화수소를 수소 공여체로 이용하는 홍색광합성유황세균

4군) 유화수소를 수소 공여체로 이용하는 녹색유황세균

이들은 하천이나 호수의 밑바닥 또는 담수상태의 논 토양 표면을 피펫으로 채취하여 위상차현미경으로 직접 검경하면 식별이 가능하다. 특히 1군의 Beggiatoa, Thioploca, Thiothrix, Achhromatium 등은 세포가 특이하고 막에 둘러싸인 사상체를 갖고 있기 때문에 식별이 용이하다. 2군에는 Macromnas, Thiovlum, Thiospira, Thiobacillus 등이 포함되며 Likske배지(배지27) 또는 배지28을 사용하여 분리한다. 특히 30℃에서 6∼8주간 집적배양하면 Thiobacillus는 쉽게 순수분리할 수 있다. Th. thioparus 는 한천배지상의 콜로니를 평판희석법으로 계수하고, Th. Thiooxidans 등의 호기성유황세균은 직접 검경하여 계수한다. 3군에서는 Thiopedia, Thiocapsa, Thiocaptyon, Thiospirlluium 등이 있으며, 균분리를 위한 집적배양은 30 ℃에서 25W 전구를 30cm거리에서 조명하며 6∼8주간 정치배양시킨다. 분리배지(배지29)를 사용하고 계수는 MPN법으로 한다. 4군에는 Chlorobium, Cylindoea, Chlorochromatium 등이 포함되고, 3군과 같이 MPN법으로 계수하며, 녹색광합성 유황세균배지로서 Larsen배지가 알려져 있다.

 

5. 유황세균의 계수와 분리

미생물의 대부분은 생육할 때 유황화합물을 필요로 한다. 유황화합물은 SH-산소, coenzyme A, glutachione 등의 coenzyme 또는 cystein, methionine 등 세균성분의 필수요소가 된다. 생육에 필요한 유황화합물은 주로 유산균으로 세균 내에 호흡, 환원되어 필요한 모든 분자로 합성되며 이것을 동화적 유산환원이라고 한다. 또한 젖산, 피루브산 등의 특정한 유기물을 전자공여체로 이용하여 이화적 유산환원으로 유산염을 말단분자수용체로 이용하여 생육하는 세균들을 총칭하여 유산환원균이라고 한다. 유산환원균은 포자의 유무에 따라서 2속으로 구분되는데, Desulfovibrio속은 포자가 없고, 1개의 극편모가 있고 cytocrome C3와 Desulfoviridine를 함유한다. 또한 DNA의 GC포함은 포자가 있는 Desulfotomaculum속보다 높다. Desulfotomaculum속은 주편모를 갖고 cytocrome b가 있으나 desulfoviridin은 함유하지 않는다.

유산환원균은 유산염을 환원하여 유화물을 생성하는 특이한 기능을 가지고 있으므로 철염을 공존시켜 유화물을 흑색의 유화철로 발색, 침전시키므로 다른 세균과 쉽게 식별할 수 있다.

 5.1 유산화원균의 계수

1) 시료채취와 조제

논 토양 중 유산환원균 밀도는 부분에 따라 현저하게 다른데 목적에 따라 시료채취를 달리해야 한다. 포장 중 세균수를 평균치로 알고자 할 때는 5∼10g씩 여러 곳에서 시료를 채취한 뒤 잘 혼합하여 1개의 시료로 사용한다. 미소부위의 세균분포를 조사하기 위해서는 한 다발의 유리세관(외경2mm정도)을 논 토양에 꽂아서 각각 소량의 토양을 뽑아올려 서로 다른 위치에서 토양을 채취한다. 침수토양의 산화층과 환원층을 분리하여 채취하는 경우는 토양표면을 일정한 철판(가로, 세로, 높이가 약 40 cm정도)으로 격리시키고 토양표면을 교란시키지 않도록 주의해서 물을 뽑아내고 침출된 산화층을 백금이로 채취한다. 이 때 토양층의 색이 달라짐에 주의해서 환원층의 토양이 혼입되지 않도록 한다. 나머지 산화층을 제거하고 환원층 토양을 채취한다.

2) 희석수의 조제

침수토양은 일반적으로 잘 분산되나 유산환원균이 생육하여 응집체를 형성할 경우에는 유리봉, 음파처리로 붕양시킬 필요가 있다. 유산환원균을 통성혐기성세균이므로 호기상태에서 희석현탁시키면 2∼3시간 후 균의 생육이 정지되거나 사멸하므로 산소와의 접촉을 피하는 특별한 조작이 필요하지만 논 토양시료는 호기성세균을 취급하는 경우와 같이 할 수 있다.

3) 배양조건

유산환원균은 편성혐기성균이므로 생육시, 특히 접종량이 적을 때 밀접한 혐기조건을 필요로 하며 배지의 Eh를 0 ∼ -200 mV로 유지시켜야 한다. 배지의 Eh를 낮게 유지하기 위해 첨가되는 환원제로는 thioglicol산, ascorbic산, cycsteine, sodium sulfer 등이며 철도 유효하다. 유산환원균은 생육할 때 균체구성을 위하여 CO2를 다른 세균에 비하여 2∼3배 많이 고정하며 유기탄소화합물을 필요로 함으로 효모유출물이 가장 유효한 것으로 알려져 있고 대부분의 균주가 에너지원으로 이용하는 탄소원은 젖산과 피루브산이다. 유산환원균 중에는 호염성도 있으며 이러한 균을 배양하는 데는 식염의 첨가(5% 정도)가 필요하다.

-  희석평판법 -

일정한 희석단계의 시료를 배지30을 사용하여 Desulfovibrio속은 30℃로, Desulfo tomaculum속 중 고온성균은 55℃, 중온성은 37℃로 배양한다. 평판작성법은 두 가지 방법이 있는데 하나는 통상 사용하는 평판법으로 평판을 작성하여 혐기적으로 배양하는 것으로,혐기조건을 만들기 위하여 진공상태를 만들 때 샤아레 뚜껑에 물이 평판표면에 떨어지는 것을 방지하기 위하여 샤아레를 거꾸로 놓아서는 안된다. 왜냐하면 진공일 때 한천평판이 떨어질 우려가 있기 때문이다. 다른 하나는 이중 샤아레법으로 살균된 샤아레 뚜껑에 배지를 넣고 시료를 접종한 뒤 그 위에 샤아레를 같은 방향으로 포개어 놓는 것으로 계수만 하고자 할 때나 대량의 시료를 일시에 취급하고자 할 때 편리하며 호기성 평판배양과 같은 속도로 평판작용이 가능한다.

- Weinberg관법 -

시험관(10×150mm) 선단부까지 배지를 채워 살균한 후 45℃ 용해상태로 시료(0.1㎖ 정도)를 접종하고 살균된 고무마개를 이용하여 상하로 전도시키고 배양하여 생성된 흑색colony를 계수한다.

- 희석빈도법 -

호기성균과 같은 조작으로 액체배양을 하여 배지의 흑화(유화물심전) 유무에 따라 MPN법으로 계수한다. 시험관 내를 혐기적으로 유지하기 위해서 질소, 아르곤 가스로 치환하거나 산소흡수부위를 갖는 특수한 시험관을 이용한다.

 5.2 유산환원균의 분리

희석평판법, 이중 샤아레법, Weinberg관법으로 생성된 colony 가운데 적당한 것을 백금이로 떼어내어 접종시 사용했던 배지에 평판배양하면 좋다. 순수분리되었는지 확인하는 방법은

① 현미경관찰에 의한 세포의 균일성

② beef extract agar사면배지에 호기배양

③ beef extract agar 배지에 침전배양

하여 ①에서 세포형태가 균일하고, ②와 ③에서 생육하지 않으면 순수분리된 것으로 본다.

 

6. 철대사균의 분리

  6.1 철산화세균

철을 산화하는 미생물의 대부분은 수생으로 토양중에서 이들의 역할은 불분명하다. 철을 산화하는 미생물 중 유기영양성(heterotrophic)은 철산화에 의한 에너지를 이용하지 않으면 안 된다. 어떤 세균의 종류는 체외에 산소를 방출하여 균체 주변에 산화철 피막이 형성되는 경우가 있다.철을 산화하는 절대적무기영양성생물은 Gallionella ferruginea, Thiobacillus ferrooxidans, ferrobacillus ferroxidans에 불과하여 Lepthothrix ochraceae처럼 유기물이 있으면 철을 이용하지 않고 유기물이 없으면 철산화에 의한 에너지를 획득하는 조건적무기영양생물(facultative autotroph)도 존재한다.

1) 철산화균의 분리

Fe2+는 중성부근의 용액 중에서 용존산소에 의해서 화학적으로 산화되며 철을 산화하는 세균이 발견되는 경우는 산소분압이 낮거나 혹은 강산성 조건인 경우가 많다. 실험상 중성부근의 배지에서는 공기에 의한 산화와 생물적 산화의 구별이 곤란하므로 분리 및 배양에 사용하는 대부분의 배지는 산성의 무기배지이다. Temple배지(배지31) 또는 Leathen배지(배지32) 500㎖를 건열살균한 1ℓ 삼각 플라스크에 넣고 토양 1g 정도를 접종하여 면전한다.

30∼35℃로 항온하여 무접종에 비하여 산화 후의 침전이 현저한 플라스크를 선별하여 현탁액 몇 ㎖를 무균적으로 새로운 배지에 2회 이상 반복하여 이식한다. 사용한 배지의 특성상 철산화균 이외의 미생물은 생육하지 않는다.

6.2 철환원균의 분리

토양에서 분리되는 조건적 혐기성균의 대부분은 철환원능력이 있으며 철환원균은 세균뿐 아니라 효모류도 있는데 적당한 배지에 토양현탁액을 첨가해서 강한 환원능을 갖는 균주를 선별한다. 기본배지(배지33)에 한천 2% 해당량을 가하고 직경 9cm샤아레에 분주하고, 토양현탁액 1㎖를 접종하여 30℃로 5∼10일간 배양한다. 생성된 colony를 순수분리 하여 이 중에서 절대적혐기성은 제외시킨다.

1) 철환원균의 계수

기본배지(배지33)1ℓ에 구연산제이철 2g과 한천 20g을 가하여 살균한 뒤 30㎖ 시험관에 10㎖씩 넣는다. 토양현탁액을 접종하고 배지가 고형화되면 2% 한천액 5㎖를 가하여 30℃에서 1주간 배양하고 생육된 colony주변에 철이 환원되어 탈색된 것을 철환원균으로 계수한다.

 

7. 망간산화균

1) 망간산화균의 분리

토양시료의 성질, 분리되는 미생물의 종류에 따라 사용되는 배지가 달라진다. Beijerinek배지(배지34)는 에너지원으로 유기물이 포함되지 않아 무기영양성세균 분리에 적당하며 pH가 높은 것이 특징이다. Gerresten배지(배지35) 및 Bromfield(배지36)에 생육하는 망간 산화균의 다수는 유기영양성이다.

어떤 배지라도 20㎖를 샤아레에 넣고 토양현탁액을 접종하여 흑자색의 망간산화반에서 균을 분리한다. 배지온도는 30∼35℃가 적당하다.

 

8. 망간환원균

토양 중 조건적혐기성균의 대부분은 망간환원능을 갖고 있다. 또 절대적혐기균의 일부도 망간을 환원시키며 망간환원균은 철환원균보다 보편적으로 존재하며 망간환원능을 갖지 않는 조건적혐기성균은 분리하기 어렵다. 망간환원균을 분리하는 데는 유기물을 포함하는 적당한 배지에 토양현탁액을 접종하여 혐기적으로 배양하여 생성되는 colony로부터 균을 분리한 후 망간환원능을 조사하면 좋다.

1) 망간환원균의 분리

망간환원균용배지(배지37)에 한천을 2%(W/V) 가한 후, 살균하여 15㎖씩 샤아레에 가한 뒤 토양현탁액을 접종하여 30℃로 5∼10일간 배양한다. 생성된 colony에 균을 순수분리하고 그 가운데 절대적혐기성균은 제외시킨다.




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