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미생물이야기 토양보다 세균, 방선균, 사상균의 생육이 현저히 높은데 이는 식물뿌리의 영향을 받기 때문이며 이 영역을 근권(rhizosphere)이라 한다.
2013-08-13 16:11:06
이엠생명과학연구원

근권 미생물

 

식물뿌리에 근접해 있는 토양이 멀리 있는 토양보다 세균, 방선균, 사상균의 생육이 현저히 높은데 이는 식물뿌리의 영향을 받기 때문이며 이 영역을 근권(rhizosphere)이라 한다.

 

1. 근권 토양 채취법

뿌리 주위에 부착된 근권 토양을 일반적인 희석평판법의 희석용 살균수에 옮기고 알코올로 화염살균 된 고무마개로 봉한 후 10분간 진탕한 다음 근권 토양의 제 1차 희석현탁액으로 한다.

이하 희석평판법에 따라 10배 간격으로 희석현탁액을 만든다.

 

2. 근권 토양중의 생균계수와 분리

 

2.1 희석평판법

토양현탁액의 일정희석액을 희석평판법에 의해 생균수를 측정하여 필요에 따라서는 평판상의 콜로니를 적당한 한천사면배지를 이용하여 분리한다.

일반적으로 근권 토양 중의 균수는 비근권 토양중의 미생물보다 많아 세균은 10∼100배, 방선균이나 사상균은 10배 전후이므로 이를 고려하여 접종액의 희석농도를 조절한다.

2.2 영양요구성에 따른 근권 미생물의 분류

일반적으로 근권 토양은 비근권 토양에 비해 세균, 특히 그람음성 무포자 세균, 아미노산 요구균, 비타민 요구균, 당 발효균, methylene blue 환원균 등의 균수가 높고 전 균수에 대한 생균수의 비가 높으며, 생리적 활성이 강한 균이 많다.

이 현상은 식물뿌리로부터 근권에 분비되는 여러 종의 유기물, 뿌리로부터 떨어지는 표피조직, 또는 근권 미생물이 생산하는 대사물질이나 항생물질 등에 기인하는데 이를 근권 효과(rhizospere effect)라고 한다.

근권토양에 있는 미생물의 특성을 정확히 파악하기 위해서는 각 특성에 맞는 배지의 선택이 필요하다.

2.3 실험방법

1) 전기의 방법에 의해 조제된 근권 토양을 토양침출 한천배지를 사용하여 희석평판법으로 균을 배양한다. 토양침출액은 비옥한 토양 100g에 수돗물 1ℓ를 가하여 120℃에서 20분 autoclave하여 추출한다. 깔대기로 여과하고 물을 가해 전 량을 1ℓ로 한다.

- Soil extract agar medium -

Soil extract

1000㎖

 

K2HPO4

0.2g

 

Agar

15g

 

PH

6.8

이 배지는 세균에 대해 선택성에 낮아 시료 중의 세균을 비선택적으로 분리할 때 사용한다. 하나의 희석액에 대해 한천평판은 5목으로 하고, 28℃에서 12일간 배양한 콜로니를 계수한다. 2) 이하의 조작을 하지 않을 때는 콜로니를 떼어내어 K2HPO4 0.2g, yeast extract 0.1g을 가한 토양침출액 한천의 고층배지에 배양한다.

 

2) 평판에 생육된 세균 콜로니를 YS배지(토양침출한천배지에 1g의 yeast extract를 첨가한 것) 사면에 이식하여 28℃에서 5일간 배양한다.

3) 각 균주를 Lochhead - Chase배지의 7종의 액체배지 5mℓ를 넣은 시험관에 이식하고 26∼28℃에서 5일간 배양한다.

① 기본배지 (B배지)

Glucose

1.0 g

NaCl

0.10 g

K2HPO4

1.0 g

FeCl3

0.01 g

KNO3

0.5 g

Distilled water

1,000 mℓ

MgSO4

0.2 g

pH

6.8

CaCl2

0.1 g

- -

 

② 아미노산함유배지(A배지) : B배지 + 0.4% casemino acid

③ 발육인자함유배지(G배지) : B배지의 기본 인자에 다음과 같은 발육인자를 가한다.

Cysreine

50μg

Riboflavine

200μg

Giaime

100μg

Inositol

500μg

Biotine

0.1μg

Vitamin B12

2.0μg

Pyridoxine

200μg

+

-

Pantoteine

100μg

Medium B

-

Nicotinic aicd

100μg

- -

 

④ 아미노산 + 발육인자 함유배지(AG배지) : B배지 + A배지의 아미노산류 + G배지의 발육인자류

⑤ 효모추출액 함유배지(Y배지) : B배지에 효모추출물을 0.1%가 되게 가한다.

⑥ 토양침출액 함유배지(S배지) : B배지 750mℓ에 토양침출액(1:1) 250mℓ를 加한다.

⑦ 효모추출액 + 토양침출액(YS배지) : S배지에 효모추출물 0.1%가 되게 가한다.

4) 5일간 배양 후, 각 배지에서 생육을 탁도로 측정한다.이 경우 같은 배지에서의 탁도를 최저부터 최고까지 0∼4의 5단계로 표시한다.

생육이 0∼2이면 생육불량, 3∼4의 것은 생육양호로 한다.

5) 위 결과에 따라 세균군을 영양요구성에 따라 다음과 7가지 유형으로 본다

① 단순영양요구균

B배지에서 생육 양호

② 한 종 내지 다수 종의 아미노산요구균

A배지에서 생육 양호 ,B배지에서 생육 불량, A, G 두 배지에서 동등한 생육을 하는 것은 cysteine만 요구하는 균이다.

③ 생육인자요구균

G배지에서 생육 양호. B, A배지에서 생육 불량

④ 아미노산 + 생육인자요구균

AG배지에서 생육 양호. B,A,G배지에서 생육 불량

⑤ 효모추출액 요구균

Y배지에서 생육 양호. B,A,G,AG,S배지에서는 불량

⑥ 토양침출액 요구균

S배지에서는 생육 양호. B,A,G,AG,Y배지에서는 불량

⑦ 효모추출액 + 토양침출액 요구균

YS배지에서만 생육 양호. 그 밖의 배지에서는 생육 불량

 영양요구성에 의한 세균구분

배지

균군

B

A

G

AG

Y

S

YS

1

+

5 5 5 5 5 5

2

-

+

(+)

5 5 5 5

3

-

-

+

5 5 5 5

4

-

-

-

+

5 5 5

5

-

-

-

-

+

5 5

6

-

-

-

-

-

+

5

7

-

-

-

-

-

-

+

+ : 생육양호            - : 생육불량
특히 G의 +는 Cysreine을 요구하는 군




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