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미생물이야기 근면 미생물의 계수와 분리
2013-08-13 16:12:12
이엠생명과학연구원

근면 미생물의 계수와 분리

 

근권에서도 특히 뿌리에 직접 접촉되어 있는 토양입자가 점유하는 부분을 근표면이라고 한다. 근표면(rhozoplane)과 그 이외의 근권을 확실히 구분하는 것은 곤란하지만 일반적으로 떨어져 나온 뿌리의 표피조직이나, 뿌리의 연속세척액 등에 의해 분리된다.

 

 

1. 희석평판법에 의한 미생물 계수

1) 근권토양 제 1차 현탁액으로부터 살균된 핀셋으로 뿌리를 꺼내어 직경 2mm의 유리알이 들어있는 별도의 희석용 살균수가 들어있는 용기에 옮긴다. 이 때 용기와 용기 내의 살균수의 중량을 측정하여 뿌리의 무게를 계산한다.

2) 20분간 진탕기에서 진탕시킨 후 통상의 희석평판법에 의해 일련의 희석현탁액을 조제한다.

3) 이하 통상의 희석평판법으로 처리하며 균수은 살아있는 뿌리의 단위중량당으로 표시한다.

2. 근면의 살균상태 사상균의 계수와 분리

희석평판법으로 계수된 사상균은 주로 휴지상태로 존재한 포자에서 유래된 것이다.

근권 특히 근면에서 생리활성이 높은 균사상태의 사상균은 식물뿌리의 기능에 중요한 관계가 있으므로 사상균 조사에는 근면의 균사 이외의 포자를 제거하는 방법이 필요하다. 그러므로 근면에 부착된 사상균 포자를 제거하기 위해, 포자가 균사보다 세척시 쉽게 떨어져 나가는 성질을 이용한 근연속세척법(serial root - washing technique)을 이용한다.

- 방법 -

1) 토양이 부착된 근시료를 잘 흔들어 토양을 제거한다. 그리고 해부가위로 각각의 뿌리를 끊어 살균수가 들어있는 페트리 접시에 넣고 잠시 방치한 다음 조심스럽게 핀셋으로 토양입자를 제거한다. 이러한 방법으로 토양을 씻어내어 살균수가 혼탁하지 않을 때까지 반복한다.

2) 다음은 근을 5cm길이로 끊어서 1개당 30mℓ용량의 용기에 넣고 살균수 10mℓ를 가하고 진탕기(300rpm/min)에서 2분간 진탕한다. 진탕 후 물을 버리고 다시 살균수 10mℓ를 가한다. 이러한 조작을 20회 정도 반복하는 것이 좋다.

3) 포자를 제거한 근은 건열살균된 여지로 수분을 제거하고 해부용 칼로 2mm크기로 전단하여 미리 준비된 한천평판 배지 속으로 가볍게 삽입한 후 25 ℃에서 배양한다.

4) 배지상에서의 사상균의 생육속도는 배지나 균의 종류에 따라 일률적이 아니며,생육이 빠른 것은 3∼5일,늦은 것은 2∼3일간의 배양이 필요하기도 하다.

따라서 콜로니계수도 1번으로는 충분하지 않으므로 상기의 배양일수에 따라 여러 번 반복하는 것이 요망된다.

특히 주의할 점은 Rhizopus, Trichoderma, Fusarium 등은 일반적으로 생육이 왕성해 4∼5일간의 배양에도 콜로니 형성이 이루어져 다른 균의 생육을 저해하거나 다른 콜로니를 덮어 계수와 분리를 곤란하게 한다. 이런 문제를 예방하기 위하여 이들 사상균의 생육속도를 억제하는 배지의 선택이 필요하다.

이러한 목적으로 사용되는 배지로는 Czapek한천배지, Martin & johnson의 rose bengal배지, Lochhead & Chase의 토양침출한천배지, czapek - doxgkscjsqowl 등이 이용되는데 배지선택은 실험목적에 따라 하며, 특정 사상균의 계수와 분리를 할 때는 선택성 배지를 사용한다.

한천평판에서 분리된 균의 배양은 보통 potato - dextrose한천(PDA)을 이용하지만 동정보전을 위한 배지는 균의 종류에 알맞게 선택한다. 특히 근시료에 분리된 사상균은 PDA배지상에서는 포자를 형성하지 않는 것이 많으므로 이러한 균의 동정에는 potato - carrot한천(PCA), 옥수수 한천(corn - meal), cellulose - yeast extract 한천배지(cellulose 분말 12g, yeast - extract 4g, 한천10g , 수돗물1ℓ) 등을 병용할 필요가 있다.




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