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미생물이야기 근내부 미생물의 계수와 분리
2013-08-13 16:12:50
이엠생명과학연구원

근내부 미생물의 계수와 분리

 

1.희석평판법

1) 근내부 시료조제

① 근표면 토양을 충분히 제거한 근을 표 10-2에 표시된 살균제로 표면살균을 하고 살균수로 충분히 씻는다. 1∼7에 의한 살균은 살균처리 전에 시료를 적당한 크기로 절단(식물뿌리의 경우는 1cm)하고, 75% 에탄올에 수 초간 침지하여 시료표면을 친수성으로 한 후 살균수로 처리한다.

② 살균된 뿌리 일정량(약 1∼2g)을 해부용 가위로 0.5cm 전후의 크기로 절단하여 살균된 유발에서 층분히 마쇄하고, 100mℓ의 희석용 살균수에 넣고 진탕기에서 10분간 진탕하여 뿌리 내부시료의 제1 현탁액으로 한다.

표10 - 2 표면살균제와 살균법

살균수

농도(%)

살균시간 (분)

살균 후 세척

1.포르말린용액

51

1~5

70% 에탄올, 살균수

2.과산화수소액

3

1~5

살균수

3.과망간산칼륨

2

1~5

살균수

4.차아염소산소다, 차아염소산칼륨

0.35

1~5

살균수

5.염화제2수은

0.1

1~5

70% 에탄올, 살균수

6.에탄올

75

1~5

살균수

7.질산은

1

1~5

70% 에탄올, 살균수

8.Ethylene oxide, propylene oxide

밀봉된 용기에 2mℓ를솜에 묻혀 넣는다.

30

살균수

2) 평판법에 의한 계수 분리

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근 내부 시료의 제1현탁액을 가지고 희석평판법에 의해 미생물 계수 및 분리를 하며 경우에 따라서는 고차 희석액으로 한다.

 

본 법에서 주의할 점은 저차 특히 제1차 희석현탁액의 평판에서 세균, 사상균의 콜로니 형성이 저해되는 경우가 있다, 원인은 확실하지 않지만 이러한 경우를 대비해서, 고차(재 3∼4차)희석현탁액을 가지고 평판배양을 할 필요가 있다.

2. 근분해법

① 토양을 제거한 근을 10mℓ 살균수에 반복 10회 세척한 다음 여지로 수분을 제거한다.

② 해부용 가위로 2mm의 크기로 절단하여 살균수가 담긴 페트리 접시에 놓고 살균된 칼과 핀셋을 사용하여 표피부와 내부조직으로 구분한다.

③ 양부로 구분한 시료와 세척된 뿌리를 2mm로 절단하여 각각 별도의 Czapek한천배지 위에 놓고 25℃에서 3주간 배양한다. 이상의 조작은 무균적으로 한다.

④ 배지의 콜로니를 계수하고 필요에 따라 분리, 동정을 한다. 이 방법에 의해 표피에서 분리된 사상균은 근표면과 표피내부 양쪽에서 생육된 것으로 표피 내부의 사상균을 조제하려면 근표면을 살균하는 것이 좋다.

 

 

 

3. 근마쇄법(근마쇄법)

① 부착된 토양을 살균수로 충분히 씻어주고 0.1% HgCl2로 1∼2주간 살균처리한 후 생근 2g을 100㎖ 살균수와 함께 blender에 넣고 1∼2분간 마쇄한다.

② 0.25∼0.5mℓ의 마쇄현탁액을 페트리접시의 rose benegal 한천배지 평판상에 접종하고 살균된 유리봉으로 배지평판전면에 도말한다.

③ 25℃에서 수일간 배양하고, 콜리니 계수 및 분리를 한다.

④ 평판상에서 세균생육이 왕성할 때는 사상균의 생육이 저해되므로, 이 때는 근현탁액을 적당한 농도로 희석하여 사용하거나, 배지 중의 항생물질 농도를 높여 사용하면 된다.




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