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미생물이야기 선상균, 효모, 방선균을 한천사면에 배양 후 -20℃의 저온에서 보존하며 분산매는 사용하지 않는다.
2013-08-13 17:08:09
이엠생명과학연구원

보존

실온 또는 2∼10℃의 저온에서 보존한다. Blakeslea, Choanephora 등의 저온에서 사멸되기 쉬운 것은 20℃정도에서 보존한다.

1. 습도

보존 시 다습한 곳은 피한다. 습도가 높으면 푸른 곰팡이 등이 습기를 흡수한 솜 마개에서 발육시험관 내부로 침입하여 다수의 균주가 오염되는 경우가 있다. 그러므로, 여름철에는 면전부분(시험관내)을 화염멸균할 필요가 있다. 즉 습도를 낮게 제어하는 저온실(10℃, 상대습도 70%)에 보관하는 것이 안전하다. 밀폐된 상자에 보관하거나 배지의 건조를 막기 위해 솜 마개를 유산지 등으로 싸두면 솜 마개가 배지의 수분을 흡수하여 오염을 유발시키는 원인이 된다. Screw cap이나 silicone스폰지 배양마개를 사용하여 보관하면 오염도를 낮출 수 있으며 건조도 피할 수 있다.

     2 대사속도 저하에 의한 보존법

  

           2.1 반고체 한천

고층으로 굳힌 반고체 한천(soft agar)배지에 천척배양하여 솜 마개 대신에 파라핀을 흡수시킨 코르크마개 또는 네오프렌마개 등으로 밀봉하여 5℃∼실온에서 보존한다. 대장균군, pseudomonas, bacillus 등의 보존에 이용되며 1∼수 년간 보존할 수 있다.

       2.2 유동파라핀 중층법

한천사면배양 또는 천척배양에서 유동파라핀으로 중층하여 보존한다. 유동파라핀에 의한 중층은 배지의 건조를 방지하며 산소공급을 차단하여 대사속도를 저하한다. 고순도 백색 유동파라핀(중성, 비중 0.8∼0.9)을 121℃ 60∼120분 증기멸균한 후 110∼170℃에서 1∼2시간 건조하여 증기멸균시 흡수된 수분을 제거한다. 또한 CaCl2를 소량 가하여 증기멸균한다. 충분히 생육된 한천배양 위에 멸균된 유동파라핀으로 중층한다. 중층높이는 한천사면의 끝(천척배양은 한천표면)으로부터 1㎝정도가 좋다. 이보다 높으면 혐기 상태가 되어 좋지 않으며 한천의 끝이 노출되면 배지가 보존 중에 건조된다.

저온 또는 실온에서 보존하며 1∼수 년간 보존이 가능하다. 이식배양 할 때는 시험관 기벽으로 균체를 흘려 떨어뜨려 적당한 배지에 이식하여 증식한 다음 새로 조제된 배지에 재이식 배양하여 파라핀을 제거한다.

이 방법은 사상균, 효모, 세균, 방선균에 적용된다. 특히 동결건조가 곤란한 선상균 그리고 배지 상에서 포자를 형성하는 선상균(담자균의 배양 등)의 간이보존법으로 적당하다. 담자균은 3년 정도 효모는 2년 정도 보존가능하다. 일부 사감되기 쉬운 효모는 6개월 간격으로 계대배양한다. 보존이 나쁜 선상균으로는 Blakeslea, Chaetomium, Circinella, Cunningha- mella, Choanephoraceae 등이며, 세균으로는 Azotobacter, Lactobacillus, Leuconostac, Mycobacterium, Rhodospirillum, Salmonella, Nocordia 등이다.

        2.3 유기성분이 없는 액체에 의한 보존법

1. 증류수

선상균, 효모, 방선균의 한천사면배양에 6∼7㎖의 증류수를 가해서 세포, 포자, 균사를 잘 현탁하여 다른 시험관에 현탁액을 옮겨 밀봉한 후 실온에서 보존한다(1∼6년 보존가능)

2. 식염수

한천사면에 배양된 세균균체를 증류수로 1회 세정하여 1% 식염수에 현탁한 후 밀봉하여 실온에 보존한다(14∼36개월 보존가능)

3. 희박한천법

방선균의 한천사면배양에 1/10,000 농도의 Triton x -100 용액(보온제)을 가해서 포자현탁액을 만들고, 가온용해된 한천액을 가해 최종 한천농도를 1.25g/ℓ로 하여 밀봉한 후 5℃에서 보존한다(3년간 보존가능)

 

   3. 동결보존법

세포를 동결, 대사활동을 정지시켜 세포를 휴지상태로 하여 장기간 보존하는 방법이다. 방법으로는 동결에 의해 형성된 빙정의 상태나 전기적으로 -20℃∼-80℃로 온도를 낮추어 하는 것과 액체질소(-196℃) 중 또는 다른 종류의 기상(-150∼-170℃)중에서 보존하는 방법이 있다.

3.1 한천사면배양의 동결보존(-20℃)

선상균, 효모, 방선균을 한천사면에 배양 후 -20℃의 저온에서 보존하며 분산매는 사용하지 않는다. Aluminum 마개 배양튜브(2.5∼7.5㎝)내의 한천사면(배지량 3㎖)에 균을 배양하여 포자형성 균주는 포자형성이 시작하는 시기, 또는 포자를 형성하지 않는 균주는 균선의 생육이 왕성한 시기에 배양튜브를 단단히 밀봉한 후 보존한다. 배양이 오래되거나 배지가 부적당하면 보존능이 낮아진다. 2년마다 계대배양을 하면 거의 전 균주를 보존할 수 있다.

Curvularia, Helminthosporium 등은 보존성이 낮다. 방선균(Streptomyes, 포자를 형성하지 않는 균주 포함)의 경우는 screw cap시험관의 한천사면에 배양(14일간)하고, 동결보존하여 1년마다 계대배양하면 전 균주를 유지할 수 있다는 보고도 있다.

동결된 균주를 사용할 때는 실온에 방치하여 해동한 후 사용한다. 해동된 균주를 재동결하면 세포의 생존능이 낮아지므로 한번 해동한 균주는 보존용으로 다시 사용하지 않는 것이 좋다. 보존 중의 온도의 변동(특히 0∼-20℃ 사이의 변동은 균주의 사멸을 촉진하므로 보존온도의 관리에 주의하여야 하며 보존 시 용기는 완전히 밀봉하여야 한다.

3.2 세포현탁액의 동결보존(-20℃)

정상기에 달한 배양세포를 적당한 분산매에 현탁하여 밀봉한 다음 -20℃에서 동결보존한다. 세균에 많이 이용한다.

3.3 세포현탁액의 동결보존(-70℃)

전 항과 같은 방법으로 만들어진 세포현탁액을 대개는 그대로 또는 한제에 넣어 동결한 후(동결건조법 참조) -70℃ 전후의 온도에 옮긴 후 보존한다.

동결시료 사용 시는 시료를 37∼40℃의 온수에 넣어 급속히 해동한 후 사용한다. 이 방법은 세균에 많이 이용하며 표 1와 같은 분산매를 이용한다.

표 1 미생물 동결건조에 의한 보존방법

미 생 물

분 산 매

보존온도

보존기간(년)

Erwinia, Rhizobium, Xanthomonas

Mycobacterium

Dermatophytes(3gen, 14spp.)

Acetobacter, Gluconobacier

Candida, Saccharomyces

Acetobacter, Lactobacillus

Leuconostoc, Micrococcus


Streptococcus, Saccharomyces

Bacteria(33gen, 140spp.)

Saccharomyces

Bordetella

Bacillus, Klebsiella, Salmonella, Streptococcus, Vibrio

15% glycerine +fresh liquid medium

Skim milk

Litmus milk

Serum(human)

10% 벌꿀

5% 벌꿀

15% glycerine +1/15M phospate buffer


10% glycerine

Liquid culture

15% glycerine + fresh liquid medium

5% Mucin을 1/2 링게르액 + 1/2 생리식염수에 가함

 

- 20℃

- 20℃

- 22℃

- 52℃

- 28℃

- 30℃

- 40℃

 

- 53℃

- 60℃

- 70℃

 

- 79℃

 

1.5 이상

1 - 5

2

 

4.5 이상

1.5 이상

1

(Bioaassay용)

1.5 이상

2 - 3

4

 

2

 




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