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미생물이야기 선상균, 미세조류, 원생동물, 박테리오 파지의 장기보존법, 또는 직접 Bioassay에 사용하기 위한 접종균의 보존에 이용된다.
2013-08-13 17:08:50
이엠생명과학연구원

액체질소에 의한 동결건조

세포를 분산매에 현탁하거나, 한천배양 그대로 액체동결하여 질소(-196℃)중이나, 그 외의 기체상에서 보존한다. 동결건조나 그 밖의 건조처리를 수반하는 보존법의 적용이 곤란한 미생물, 예를 들어 일부세균(Mycoplasma, Leptospira, 수표세균, 해양세균), 배지상에서 포자(단단하고 작은 포자)를 형성하는 선상균, 미세조류, 원생동물, 박테리오 파지의 장기보존법, 또는 직접 Bioassay에 사용하기 위한 접종균의 보존에 이용된다.

분산매로는 10% glycerine, 5∼10% dimethyl - sulfoxide((CH3)2SO, DMSO)등을 이용한다. 세포를 급속히 동결하면 세포내에 빙정이 형성되어 생존율을 저하시키는 원인이 되므로 완만동결을 행한다. 즉 강하속도를 매 분 1℃ 전후로 제어하며 시료온도가 -30℃가 될 때까지 동결한 다음 시료를 액체질소 내에 넣어 급격히 온도를 하강시켜 그대로 보존한다. 보존균주를 실험에 이용할때는 급속해동(전 항 참조)을 사용한다.

1) 각 미생물의 동결보존

① 사상균 균사

1.2㎖ 용량의 동결 보존용 앰플(외경 12㎜)에 10%(v/v) glycerine을 0.8㎖ 분주한 후 면전하여 고압혐기멸균한다. 한천평판상에 배양된 사상균 콜로니에서 코르크 보러를 이용하여 균체 mat를 약 10 ㎜크기로 분리한 후 4개씩 상기의 앰플에 넣고 용봉한다. 균의 복원에는 급속해동을 한다. 이렇게 하여 보존능이 낮으면 분산매를 10% DMSO로 한다. 일반적으로 단 시간의 동결보존 후 균의 생잔이 양호하면 이후 장기보존에서도 양호한 생존을 기대할 수 있다.

② 미세조류

10% glycerine을 분산매로 하여 사상균 균주와 같은 방법으로 행한다.

③ Euglena

액체를 7.5% DMSO에 현탁하여 30℃에서 30분간 방치하여 평행에 달하면, -24℃에서 동결시킨 후 20분 후 액체질소 중에 옮겨 보존한다.

④ 원생동물(Tetrahymena)

조류를 신선한 액체배지와 20% glycerine을 같은 량 혼합한 분산매에 현탁하고, 23℃에서 30분간 방치하여 평형에 이르게 한 후 매 분 10℃ 온도를 낮춘다. 빙결점을 지나서는 매 분 1∼4℃의 속도로 -40℃까지 온도를 내리고 액체질소(-170℃)중에서 보존한다.

⑤ 박테리오 파지

세균을 포함하지 않은 용액에 같은 양의 20% glycerine을 가하고 -30℃까지 분당 1℃의 속도로 완만동결을 행한다.

2) 보존용기

보존용기는 알루미늄 또는 stainless steel로 만들어진 이중구조로 2중 벽 사이는 진공상태로 한다. 이 용기내에 액체질소를 넣어 보존용기로 한다.

3) 보존상의 주의

앰플의 밀봉이 불완전하면, 보존 중에 액체질소가 앰플 내에 들어가, 사용 시 밖으로 꺼낼 때 외부온도에 의해 액체질소가 급격히 기화 팽창하여 앰플이 폭발하는 위험이 있다. 밀봉 후 앰플을 4℃의 색소액에 담가두어 밀봉상태의 완전여부를 확인한다. screw cap 바이알의 사용은 위험하며 보존용기에서 앰플을 꺼낼 때는 플라스틱 안면 방호모를 사용하여 안전을 기한다.




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