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미생물이야기 세포는 휴지상태에 도달할 때까지 저온, 탈수 등의 과정을 거치게 되어 일부가 사멸하거나 종류에 따라 장애를 받게 되는데 이를 피할 수는 없다.
2013-08-13 17:09:37
이엠생명과학연구원

건조 보존법

건조에 의한 보존법이란 세포 내 수분의 대부분을 점하는 자유수를 건조하여 대사기능이 되는 액상을 제거하여 세포를 휴지상태로 하여 보존하는 것이다. 건조방법에 따라 (1) 승화에 의한 고상으로 부터의 건조 (2) 증발에 의한 액상으로부터의 건조로 크게 나눌 수 있다.

(1)의 방법에는 동결건조법이 있고 (2)는 미리 세포를 동결, 수분을 증발시켜 제거한 후 건조하여 보존하는 방법이다. 증발은 진공 또는 상압에서 행한다. (2)의 방법에는 L - 건조, gelatin - disk법, 토양보존법 등이 있다.

 동결건조법

동결건조법에 있어서는 미리 세포를 동결하여 수분의 이동을 억제하여 진공하에서 대부분의 수분을 승화시킨 후 나머지 얼지 않은 수분을 증발시켜 수분을 제거하는 방법이다. 세포는 휴지상태에 도달할 때까지 저온, 탈수 등의 과정을 거치게 되어 일부가 사멸하거나 종류에 따라 장애를 받게 되는데 이를 피할 수는 없다. 그래서 이러한 손실을 최소화하기 위해 적당한 보호물질을 첨가하여 실시한다.

1. 장치요소

동결장치는 크게 나누어 (1) 시료부분 (2) 수분 포집부분 (3) 진공장치의 3부분으로 되어있다. (1)의 시료부에는 두 가지 형이 있어 (2)의 수분 포집부에 연결된 도관에 앰플을 하나 하나 장착하는 다기부(manifold)식과 다수의 앰플을 내압용기 내에서 건조하는 chamber식으로 구분한다. 수분포집은 cold trap 또는 건조제(P2O5, CaSO4 등)를 사용하여 행한다. 진공펌프에는 회전식 진공펌프(도달진공도 1∼10μHg)와 유확산식 진공펌프(도달진공도 0.1∼ 0.01μHg)가 있다.

2. 분산매

분산매는 보통 고분자 물질과 저분자 물질을 섞어서 만든다. 고분자 물질 또는 이를 함유하는 것으로는 혈청, skim milk, 전분, dextran, polyvinylpyrrolidone(PVP) 등이며 저분자 물질로는 dextrose, sucrose, 유당, meso-inositol 당이나 glutamic acid - Na 등의 아미노산이 이용된다. 고분자 물질 중에서 널리 사용되는 것은 혈청과 skin milk로서 혈청은 여과멸균 후 무균을 확인한 냉장실에서 보관한다(1∼2년 보존가능). skin milk를 이용할 때는 분산매를 시험관에 소량 분주하여 증기멸균(116℃, 20분간) 후 30℃에서 2∼3일 배양하여 무균을 확인한 후 사용한다. 이 때 멸균이 완전하지 못하면 기포가 생기며 멸균조건이 너무 강하면 갈색으로 변하여 보존성적이 좋지 못하게 된다. 혈청을 이용할 때는 시판조직 배양용 혈청을 이용하는 것이 편리하며 여과멸균한다. 보존성은 혈청이 좋다.

분산매에 저분자 물질로 첨가되는 당(5∼10%) 또는 glutamic acid-Na(5%)는 건조시료와 수분함량이 과도하게 저하되지 않게 수분 완충제로서 작용한다. 동결건조시료의 보존온도가 높은 경우에는 carbonyl 기를 가지고 있지 않은 당을 이용하는 것이 좋다. 동결조건에 이용되는 분산매는 다음 표 11-3과 같다.

표 1 미생물의 동결건조에 사용하는 분산모의 조성

분 산 매

조 성

비 고

Skim milk

Skim milk 20%(W/V)

116℃, 20min, autoclave

Skim milk + Glutamic acid-Na

Skim milk 10%
Glutamic acid-Na 1%

 

Skim milk + Sucrose

                 + Glutamic acid-Na

Skim milk 3%
Sucrose 5%
Glutamic acid-Na 1%

 

Sucrose-fresh liquid medium

20% Sucrose sol. 50%
Fresh liquid medium 50%

 

Serum

Horse serum

여과살균

7.5% Dextrose + Serum

Dextrose 30g
Horse Serum(fresh) 400㎖

여과살균

5% Inositol + Serum

meso-Inositol 5%
Horse serum

여과살균

Mist desicans

Horse serum 300㎖
Nutrient broth 1.3g
Dextrose 30g
Distilled water 100㎖

Dextrose와 Nutrient broth를 증류수에 녹이고 혈청을 가한 후 교반하여 여과멸균

 

3. 앰플

동결건조에는 외경 6∼8㎜, 두께 0.6∼1.2㎜, 길이 7∼15㎝의 앰플 또는 튜브가 사용되고 있으며 각 종 앰플의 실례는 그림 11-1과 같다. 유리재질은 녹여서 봉하기가 쉽고 보존 중에 금이 생기지 않는 것이 좋다.

 

4. 세포현탁액의 분주

세포현탁액을 앰플에 분주할때는 길이 7㎝, 외경 0.9㎜의 주사침(20G. 70)을 투베르큘린용 주사관(멸균용)에 끼워 사용하면 좋다. 분주 시 조작을 잘못하여 주사침에 손이 찔리면 미생물의 종류에 따라 국부적인 염증이 생기므로 주의할 필요가 있다. 병원균을 분주할때는 사용하지 않는다. 분주량은 앰플이 커도 0.05∼0.2㎖이면 충분하다. 세포농도가 높은 편이 미생물의 생존율이 높다(특히 그람 음성세균일 경우).

 

5. 예비동결

세포현탁액은 공결점 이하에서 동결한다. 통상 시료를 넣은 앰플을 -30∼-79℃의 한제속에 넣어 행한다. 한제는 dry ice를 잘게 부숴 메틸세로솔로블, 에틸세로솔로블, 95% 에탄올 또는 아세톤과 혼합하여 만든다.

세균은 보통 상기의 방법에 의해 급속동결하지만 효모는 온도제어동결장치에서 -35℃까지 1℃/분의 완만동결을 한다.

 

6. 건조

건조는 승화에 의해 수분을 제거하는 1차 건조와 증발된 수분을 제거하는 2차 건조의 두 단계로 나눈다. 1차 건조중의 온도는 원칙적으로 사용하는 분산매의 공결점 이하에서 보존한다. 한편 다기관식 동결장치는 앰플을 한제에 담그거나, 1차 건조를 행하지 않고 예비동결 후 앰플을 다기관에 장착하여 외기에 노출된 상태로 행하는 방법이 있다. 이 때 앰플에 솜 마개를 하여 그대로 1차 건조를 하면 앰플 내의 진공도가 부족하여 건조 중 시료가 용해되는 경우가 있다. 또한 chamber식 동결건조기에 의한 방법에서 건조를 촉진시키기 위해 가온을 하는 경우가 있지만 절대로 시료가 녹아서는 안 된다.

 

7. 수분함량

수분이 1∼3%일 때는 일반적으로 보존에 큰 영향을 주지 않지만 5% 이상이 되면 보존온도가 높을 때 생존율이 저하된다.

 

8. 용봉

앰플의 용봉에는 burner가 이용된다. 용봉 시 불꽃에 국부적으로 모이면 앰플내의 음압 때문에 구멍이 생기므로 균일하게 화염을 가한다. 유리가 부드럽게 되면 앰플을 가볍게 잡아당겨 용봉한 후 용봉 부위가 약한 불꽃에 닿게 한다. 불꽃이 강하면 용봉 부위가 찌그러지며 방냉 후 또는 보존 중에 금이 생긴다.

Pyrex제 유리는 강한 불꽃을 이용하여도 용봉의 실패는 거의 없다. 일반적으로 진공도 10∼100μHg의 범위에서 용봉하지만 낮을수록 좋다. 앰플에 솜 마개를 하지 않고 동결건조를 하면 다기관에 끼어있는 앰플 끝이나, 다기관 입구가 사용 균에 반드시 오염되어 있으므로 사용 전후에 반드시 멸균한다.

 

9. 진공도 확인

용봉 후 고주파 테스터 코일의 선단을 앰플에 가볍게 접촉하여 앰플 내부를 진공방전시켜 그 색조로서 진공도를 판정한다. 청∼청남색으로 되면 진공도는 충분하다.

용봉한 후 1∼2일, 1개월 후에 진공도를 재점검하는 것이 안전하다. 앰플 용봉부에 테스터 코일을 장시간 접촉하면 충격에 의해 금이 생기므로 주의한다.

 

10. 앰플 보존

건조시킨 균주를 광에 노출하면 생존율이 저하되므로 앰플은 반드시 암소에 보관하며 온도는 저온에서 하는 것이 적당하다. 동결건조된 사상균 포자의 -70℃보존이 10∼20℃ 보존시보다 85,300배의 생잔율이 기대되는 계산이 된다(Q10은 약 2.3).

여기서 Mycoplasma는 -30℃에서 Azotobacter, Chlorobium, Chromatium, Desulfovibrio, Myxococcus, Thiobacillus, Thiopedia, Haemophilus, Lactobacillus, Neisseria, Pasteurella등은 반드시 저온에서 보존한다.

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11. 앰플 개봉과 동결건조균의 복원

 

복원 시 앰플을 끊으면 급격히 공기가 앰플 속으로 들어가 건조균이 공중에 비산되거나, 공기중의 균에 의해 오염되는 위험이 있다. 그러므로 앰플을 줄로 홈을 만들고 70% 알코올로 멸균된 가제로 앰플을 감싸서 끊어대거나, 줄로 홈을 낸 부분에 적열된 유리봉의 선단을 가볍게 접촉시켜 틈새를 만들어 그 사이로 공기가 서서히 들어가기를 기다린 후 끊는다. 솜 마개가 된 앰플은 마개 부위를 끊으면 공기가 솜 사이로 들어가므로 오염의 위험을 방지할 수 있다.

 

앰플 내의 소량의 배양액, 또는 적당한 복수액(0.3∼0.5㎖)을 서서히 가해 건조 균체를 잘 용해시켜 액체배지에 접종한다. 동시에 한천평판에 도말시켜 오염의 유무와 콜로니 형상을 확인하는 것이 좋다. 동결 건조균은 세포상해를 입을 수 있으므로 한천배지에서 생육이 되지 않는 경우가 있다. 이 때는 액체배양에서 생육된 균을 한천평판에 다시 숙주하여 배양한다.

 

 

 

12. 적용 미생물

 

사상균, 효모, 세균, 방선균과 phage에 적용된다. 사상균 중 단단하고 작은 포자를 형성하는 것에 이용되지만 Entromophthorales에 속하는 것은 부적당하다.

 

효모 중에서 Erettanomyces, Saccharomyces, Endomycopsis, Schizosaccharomyces 등은 동결건조하면 생존율이 낮아진다. 세균은 그람음성균에 감수성균이 많다. 그 외 동결건조에 부적당한 균은 액체질소에 의한 동결건조나 L - 건조를 이용한다.

 

보존기간은 수년부터 30 수년이 있지만 생존 균수의 시기적 변화에서 계산하면 Micrococcus는 수 천년동안 생존할 수 있다는 보고가 있다.

 L - 건조

L - 건조는 소량의 세포현탁액을 진공하에서 수분을 급속히 증발시키는 보존법이다. 수분의 증발을 촉진하기 위해 다공질의 담체에 가해서 증발표면적을 넓혀 하기도 한다. 장치는 동결건조장치를 사용하며 조작방법도 동결건조법에 준하여 실시한다.

이 방법은 동결건조법과 동일한 특징인 장기보존법으로 이용되고 있지만 이 건조법은 동결건조가 곤란한 미생물에도 사용할 수 있다는 이점이 있다.

1. Annear 방법

세포현탁액을 솜, peptone plug 등의 담체에 가하거나, 직접 앰플에 분주하여 건조한다. 이들 담체에 5% peptone + 5% glutamic acid-Na(또는 glucose, sorbitol 등)과 그 외의 적당한 조성의 분산매로 만들어진 농후한 세포현탁액 한 방울(0.02㎖) 내지 두 방울 가한다. 솜 마개를 앰플 내에 넣고 24시간 건조한다. 수분제거는 P2O5로 하지만 대부분의 수분을 일단 실리카겔로 제거한 후 P2O5를 사용하기도 한다. 적용되는 미생물은 효모, 세균, 편모를 가지고 있는 원생동물 및 토양아메바, 박테리오 파지, 동물 바이러스 등이다. 동결건조 감수성의 세균인 세균인 Leplospira, Treponema 등에도 적용된다.

 

2. NCIB 방법

내경 6㎜의 튜브에 5×30 ㎜의 여지조각을 넣어 담체로 하고 여기에 mist desiccans(또는 그 외 적당한 분산매)를 사용하여 만들어진 세포현탁액 약 0.1㎖를 가한다. 세포 현탁액량은 소량일수록 좋다. 솜 마개를 약 15㎜정도 앰플 내에 넣고 다기관에 장착하여 20℃로 유지되는 물속에 4∼5 ㎝의 깊이로 담근다.

탈기를 행한 후 진공펌프에 연결되어 있는 밸브를 0.5초간 연다. 그 후 매우 천천히 밸브를 열어 작은 기포가 여지조각 양면에 생길 때까지(약 5분간) 탈기한다. 약 25분간 진공건조를 행하고(이 때 온도는 10∼12℃) cold trap을 P2O5로 새로 바꾸고 건조하여 용봉한다.

Azomonas, Derxia, Cytophaga(filament형), Saprospira, Sporocytophaga, Spirillum, Vibrio 등의 동결건조가 곤란한 세균에 적용되고, 보통 동결건조보다 10∼100배의 살아 남은 균수가 얻어진다.

 

3. IFO방법

8×110㎜의 튜브에 세포현탁액 0.1㎖를 분주하고 솜 마개를 앰플 내에 넣고 다기관식 동결건조기에서 1∼2시간 건조한 후 솜 마개 상부를 진공용봉하여 저온에서 보존한다.

건조중의 앰플은 시료온도가 2∼5℃로 유지되게 하며 분산매는 세균에 3% glutamic acid-Na + 0.1M 인산완충액(pH 7.0), 박테리오 파지는 세균이 없는 용균액에 이것들을 같은 농도를 가하고 효모에는 5% glutamic acid-Na + 6% PVP + 0.1M 인산완충액(pH 7.0)을 이용한다. 용봉 직후의 시료의 수분은 12∼13시간이지만 보존 중 솜 마개에 흡수되어 약 2%까지 저하되어 안정하다. 동결건조가 어려운 효모, 세균에 적용된다.

 

4. Sordelli방법

솜 마개가 된 8×60㎜의 작은 튜브 바닥보다 약간 높은 부분의 측면에 1백금이 양에 해당하는 말의 혈청액을 넣고 균체 1백금이와 잘 혼합하여 농후한 세포현탁액으로 한다. 이것을 바닥에 소량의 P2O5를 넣은 외관(10×150㎜)에 넣고 외관상부를 가늘게 조인다. 다기관에 장착하여 충분히 진공(수 분간)한 후 용봉한다.

세균, 효모, 사상균 등 동결건조와 거의 비슷한 범위의 미생물에 적용되지만 Prototheca에도 적용할 수 있다는 보고가 있다. 그러나 감수성균의 생잔율이 낮다는 보고도 있다.

 

Gelatin Disk법

다음의 A액, B액을 같은 양을 혼합하여 pH 7.6을 확인한 후 2㎖ 정도를 소형시험관에 분주하여 121℃, 15분 증기멸균하여 사용 시까지 밀봉하여 보존한다. A, B 혼합액을 가열용해하여 50℃로 한 후 C액을 0.2㎖ 가하여 40℃ 물속에서 보존한다. 여기에 한천평판에서 배양된 세균을 현탁하여 세포농도가 5∼109 /㎖ 이상으로 한다. 파라핀(융점이 높은 것)을 녹여 그 속에 원형여지를 2분간 담근 다음 꺼내어 굳혀 멸균된 페트리 접시에 넣어 둔다. 여지는 멸균된 것을 사용하며 피펫으로 파라핀 여지 위에 세포현탁액을 적하한다. 이를 P2O5가 들어 있는 데시케이터에 넣고 감압하여 저온실에 4∼5일 방치하여 건조한다.

하루에 한번씩 진공펌프로 감압하면 건조가 빨리 된다. 건조 후 파라핀 여지를 잘라 만든 disk를 실리카 겔이 들어 있는 시험관에 넣고 밀봉하여 0∼5℃에서 보존한다. 균을 복원할 때에는 1매씩 액체배양하여 사용한다.

세균보존에 적용되며, Staphylococcus는 1년 이상, 장내세균은 5년 이상 생존한다.

A 액 : Peptone

2g

Beef extract

1g

NaCl

1g

증류수

100㎖

pH

7.6

B 액 : Gelatin(bactogelatin)

20g

증류수

100㎖

C 액 : 2.5% ascorbic acid 수용액

(사용시 조제하며 여과 멸균한다.)

 

토양보존법

세포를 토양과 혼합하여 토양을 배지로써 생육시킨 후 상압 또는 감압하에서 건조보존한다. 주로 포자형성 사상균, 방선균, 유포자세포, Rhizobium에 적용되지만 특히 사상균 및 방선균은 포자형성능이 유지되어 퇴화, 변이가 적은 보존법으로 이용되고 있다.

 

1. Greene법

옥토를 풍건한 후 물을 가하여 함수량 20%로 조절하여 시험관에 약 5g(건조물중)씩 넣고 121℃, 3시간 동안의 증기멸균을 반복한다. 포자 또는 균선의 농후 현탁액 1㎖를 가하여 실온에서 배양한 후 그대로 건조시켜 저온에서 보존한다.

 

2. 능미 등의 방법

밭 토양을 10∼15 mesh체로 거른 후 자연 건조한다. 이것을 시험관에 2∼3g씩 넣고, 사용균의 포자를 양호하게 형성하는 한천배지를 선택하여 그 액체배지 또는 희석액 1∼1.5㎖를 가하고 121℃, 20분 2회 멸균한다. 사면에 방선균, 사상균을 접종 7∼14일 배양한다. 이를 데시케이터에 넣고 감압 또는 상압하에서 건조하여 감압 또는 상압하에서 10∼13℃로 보존한다.

 

3. Gordon 등의 방법

풍건토 및 풍건된 부식을 2:1로 혼합하여 가는 체로 거른다. 이 혼합물에 탄산칼슘을 9:1 (중량)의 비율로 혼합하여, 시험관에 2㎝의 깊이로 넣는다. 솜 마개한 시험관을 비스듬히 기울여 토양혼합물을 관내에 넓게 퍼지게 하여 121℃, 1시간 증기멸균을 3일간 행한다. 토양추출물 한천에서 형성된 Bacillus 포자의 증류수 현탁액 1㎖를 가하여 충분히 토양과 혼합하고 시험관 벽에 잘 붙게 하여 고무마개로 밀봉하여 저온 또는 실온에서 보존한다.

 

4. 도변의 방법

녹소토(분재에 사용)를 수 회 증류수로 씻어 무질소배지에 넣고 고압증기 멸균한다. 남조조체의 농후현탁액을 같은 량 혼합하고, 약한 광을 조사하여 4주간 배양시킨 후 용기에 넣고 솜 마개하여 실온에 보존한다.

 

사배양법

깨끗한 sea sand를 알칼리, 산, 물로 번갈아 세정하여 시험관 또는 앰플에 2∼3㎝의 두께로 넣고 증기멸균한다. Clostridium의 배양액(포자형성을 확인) 1㎖를 첨가하여 모래와 혼합하고 진공데시케이터 내에서 건조한다. 건조 후 상압하에서 용봉하여 보존한다.

 

 자제 Bead 이용 건조법

Screw cap 시험관(15∼150㎜)에 실리카겔을 절반 정도 넣고 그 위에 glass wool 및 자제 Bead를 1다스 정도 넣어 건열멸균한다. 방냉 후 세균현탁액을 수 방울 가하고 밀봉하여 실온에 방치한다. 이 때 cap은 별도로 증기멸균한다. 또는 세균현탁액, 사상균 포자 현탁액(10% glutamic acid-Na)에 bead를 넣고 수 분간 방치하여 세포를 bead에 흡착시키고 실리카겔이 들어있는 시험관에 넣는다. 실험시에는 bead 1개를 취하여 배지속에 넣고 배양하여 사용한다. 사상균 포자, 각종 세균 및 Rhizobium에 사용된다.




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