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미생물이야기 식물의 번식에는 유성번식(有性繁殖, sexual propagation)과 무성번식(無性繁殖,asexual propagation)이 있다.
2013-08-14 12:25:54
이엠생명과학연구원

기내 영양번식

 

§1. 서론

식물의 번식에는 유성번식(有性繁殖, sexual propagation)과 무성번식(無性繁殖,asexual propagation)이 있다. 기내(器內)번식은 무성번식의 범주안에 있으나 일반 번식법과는 다르게 기내에서 이루어지는 것이다. 이러한 차이로 인하여 기내 영양계 번식(clonal propagation), 기내 영양번식(in vitro vegetative propagation) 이라고도 한다.

본 장에서는 기내 영양번식에 사용되는 기본적인 배양의 형태에 대하여 언급하고자 한다. 즉,

 

줄기의 끝부분(莖端, shoot tip)을 배양하는 생장점 또는 분열조직 배양

②식물체의 줄기와 잎줄기 사이에 형성된 눈(芽)을 배양하는 액아(腋芽, axillary bud)배양

③줄기의 일부가 포함된 마디를 절편으로 이용하여 배양하는 마디배양(node culture)에 관하여 설명

④생장점이나 액아와 같이 미리 정해진 곳이 아닌 곳에서 형성되는 부정기관(adventitious organ)

⑤체세포 배(somatic embryo)의 형성

⑥원형질체 등에서 식물체의 재생에 관하여 설명하고자 한다


§2. 식물재료의 조건 및 기내 영양번식의 특성

 

1. 식물재료의 조건

식물재료의 조건은 제5장의 §1. 식물재료의 영향에 언급되어 있다. 목본류는 초본류에 비하여 기내 영양계 번식이 훨씬 어렵다. 그 이유는

① 재생력이 낮다.

회춘을 유도하기가 어렵다.

③ 증식률이 낮다.

④ 휴면이 있다.

⑤ 목본류는 본래의 위치에서 성장과 분화를 지속하려는 습성(topophysis)이 크다.

⑥ 유전적 변이가 크다.

⑦ 배양시 삼출물이 많다.

 

2. 기내 영양번식의 특성

기내영양번식의 특성은 제1장 제1절에 이미 언급되어 있다. 현재 국내에서 기내 번식을 이용하여 경제적인 영리를 추구하고 있는 농장이 있다. 특히 본교의 졸업생이 성공적으로 조직배양실을 경영하고 있는 농장(연구소)이 있으나 방문하여 보기 바란다.

조성대 ( 81학번 ) : 0342-713-0029 (경기도 분당)

송인승 ( 81학번 ) : 0331-281-1302 (신갈 IC에서 4㎞)

박태은 ( 82학번 ) : 042-822-0324 (유성)

이 외에 김윤곤, 김기준, 황상용, 김백용, 김택원, 류제청 등이 있다.
 

§3. 기내번식의 형태

 

1. 생장점 배양(분열조직 배양)

생장점 배양은 줄기의 끝 부분(莖端, shoot tip)을 절편으로 이용하는 배양이다. 이 경단절편은 세포분열이 왕성한 분열조직(meristem)이 포함되어 분열조직배양이라고도 한다. 이러한 분열조직이 포함되었기 때문에 다른 부위에 비하여 재생이 잘된다. 생장점배양에는 크게 2가지 목적이 있다 하겠다. 부정아 형성에 의한 번식과 바이러스(1,2)를 제거하기 위하여 생장점배양을 한다.

 

1-1. 부정아 형성에 의한 번식

모든 식물의 생장점을 줄기 끝 부분에 있기 때문에 이것이 바로 생장점이 될 수 있다. 그러나 벼과와 같은 식물은 줄기 끝에 한 개의 생장점밖에 없지만 많은 식물에서는 액아가 발생하여 측지로 발생하기 때문에 발육시기에 따라 줄기 끝 부분 이외에도 생장점을 많이 가지고 있다. 그러나 이들은 정단에 생장점만큼 세력이 왕성하지 못하다.

생장점 배양시 배지에 auxin함량이 높으면 생장점 한 개에서 한 개의 싹으로 신장하지만 cytokinin의 함량이 높으면 한 개의 생장점에서 많은 不定芽(adventitious)가 발생된다. 부정아 발생은 auxin과 cytokinin의 비율에 의하여 결정된다. 물론 배지에 첨가되는 auxin과 cytokinin의 양만이 단독으로 작용하는 것은 아니고 조직 자체에 존재하는 內生的(endogenous)수준도 이에 관여하므로 절편의 성질에 따라 이를 고려하여야 한다.

생장점에서 생산된 부정아(adventitious)는 이미 분화된 기관의 세포들이 만들어 낸 식물체의 側芽와 같은 것이므로 callus에서 형성된 不定芽보다는 유전적인 변화가 적다.

생장점배양을 위한 배지조성과 배양환경은 식물에 따라 차이가 있으나 일반적으로 cytokinin은 BAP, kinetin 등이 이용된다.

 

1-2. 분열조직배양에 의한 바이러스 제거

바이러스(1,2)는 많은 식물체에 침범하여 생육을 억제하고 생산물의 질을 저하시킨다. 이들은 많은 경우 가시적인 증상이 없기 때문에 식물체의 생육이 정상적인 것처럼 보인다. 이러한 식물체로부터 바이러스를 제거하면 수량이 크게 향상되는 경우가 많다. 바이러스가 종자를 통하여 다음 세대까지는 전염되지 않으므로 종자로 번식을 하는 식물체는 큰 문제가 없으나 영양번식을 하는 식물체는 한번 이병된 바이러스가 다음세대로 계속 이어지기 때문에 심각한 문제를 초래한다.

이러한 바이러스를 제거할 목적으로 분열조직(생장점)배양이 이용된다. 바이러스에 감염된 식물체일지라도 정단분열조직(頂端分裂組織, apical meristem)에는 바이러스가 없거나, 밀도가 아주 낮으며 이곳으로부터 거리가 멀어짐에 따라 바이러스의 밀도가 증가한다. 분열조직에 바이러스가 없는 이유는 다음과 같이 추정된다.

바이러스는 유관속(vascular system)을 통하여 식물체 내부에 침입한다. 그러나 분열조직에는 유관속이 형성되지 않았으므로 침입하기 어렵다.

또 다른 침입 방법으로는 원형질연락사(plasmodesmata)를 통해 세포에서 세포로 이동하여 감 염된다. 그러나 이러한 이동은 속도가 매우 느리다. 즉, 분열조직이 분열하는 속도보다 늦기 때문에 분열조직에 침입하기 어렵다.

분열조직 세포의 왕성한 대사활동으로 바이러스의 증식이 억제된다.

생장점에는 옥신의 함량이 높기 때문에 바이러스의 증식이 방해받을지도 모른다.

 

2. 액아배양

액아(腋芽, axillary bud)는 식물체의 줄기와 잎줄기사이에 형성된 눈(芽)이다. 이 눈은 식물에 따라 가지로 성장하는 것도 있고 눈인 상태로 남아 있는 것도 있다. 그러나 만일 정아가 없어졌을 때는 정아 바로 밑 부분의 액아가 정아를 대신하기 위해서 빠른 속도로 성장한다. 이러한 작용은 정아우세(apical dominane)현상으로 이러한 정아우세현상은 cytokinins처리에 의해서 타파되어 액아를 발달시키거나 부정아를 발달시키기 위해서 cytokinins를 많이 사용한다.

 

2-1. 腋芽(axillary bud) 배양과 cytokinins

액아배양에서 경단(shoot tip)을 분리하여 이곳에서 액아를 발달시킨 다음 액아로부터 shoot를 발생시키거나 액아를 분리하여 액아로부터 shoot를 발생시키고자 할 때는 비교적 높은 농도의 cytokinin을 처리한다.

 

Cytokinins 요구도

 

대부분 식물은 계대배양을 계속하면 습관성(habituation)과 回春이 증가하여 cytokinins에 대한 요구도가 낮아진다. 또한 成熟期보다 幼相期의 재료에서 cytokinins에 대한 요구도가 낮다. 물론 pineapple科의 苗에서처럼 내생 cytokinins의 합성이 충분한 식물체는 cytokinins이 없는 배지에서도 액아의 형성이 가능하다.

 

Cytokinins에 대한 반응

일반적으로 BA처리가 효과가 좋고 kinetin, 2iP는 효과가 낮다(물론 식물체에 따라 다소의 차이는 있다. 예를 들면 철쭉류는 액아형성에 2iP가 좋다).

Auxins/cytokinins 의 비율

일반적으로 auxins 의 농도를 낮게하고 cytokinins 의 농도를 높게 하는 것이 좋다. 대개의 비율은 1:10으로 cytokinins 의 농도가 낮으면 auxins 의 기능이 활발하여 절편체에서 callus 가 형성되고 부정아의 발생이 안된다.

 

2-2. 실제의 응용

기내번식에서 딸기, 거베라, 안개초 등은 액아법을 이용하여 실제 번식에 응용이 되고 있다. 이들 식물은 배양초기에 shoot tip을 분리하는데 어려움이 있지만 식물체의 생장이 양호하고 유전적으로 비교적 안전하기 때문에 많이 이용된다.

딸기: 배양을 하여 무병개체를 생산한 후 배지에 cytokinins 류 특히 BA 나 kinetin을 첨가 하여 액아발생을 유도한다. 이후부터는 액아배양으로 계속 계대배양을 한다. 그러나 계대배양을 계속하면 생리적인 변이에 의한 이형체가 나타날 수 있으므로 계대배양을 12회로 제한하는 것이 좋다고 한다.

 

* 딸기의 기내배양 장점

- virus free 영양계를 이용할 수 있다.

- 선충(nematode) 또는 토양전염성 병원체 제거가능

- 무병의 신품종을 신속히 번식 가능

- 주년생산 가능

거베라 : 높은 농도의 auxin 배지에 shoot tip을 접종하면 많은 수의 잎원기를 가진 액아가 발 달된다. 액아로부터는 싹이 발달하게 되는데 여기서 발달된 싹을 cytokinins이 첨가된 배지에 이식하게 되면 싹으로부터는 다시 액아가 발달하고 이 액아로부터 싹이 발달하게 된다.

과수 : 과수류 번식에 액아법을 이용하면 생체에서 실시하는 접목을 행할 필요가 없기 때문에 다음과 같은 장점이 있다.

- 새로운 품종이나 식물재료의 증식이 빠르다

- 접목을 할 필요가 없다.

- 계절에 관계없이 번식이 가능하다.

 

3. 마디배양

마디배양은 줄기의 일부가 포함된 마디를 절편으로 이용하는 것이고 액아배양과는 달리 정아우세현상이 나타나도록 유도하고 배지에 cytokinins을 첨가하지 않기 때문에 많은 액아가 형성되지 않는다. 이 방법은 삽목의 방법과 같은 것이기 때문에 번식률은 이용 가능한 눈의 수에 달려 있다. 장미, 감자, 담쟁이, araucaria 등의 번식에 이용된다.

 

4. 부정기관 재생

절편체를 분리하였을 때 절편체에 존재하지 않았던 기관을 재생시키는 일은 매우 복잡한 과정이다. 절편체로부터 생기는 재생기관으로는 부정아와 부정근이 있다. 이러한 부정아와 부정근은 기관화되지 않은 callus로부터 재생될 수도 있다. 여기서는 부정아와 부정근에 대해서 살펴보기로 한다.

 

4-1. 부정아 형성

不定芽는 생장점이나 액아와 같이 미리 정해진 곳이 아닌 곳에서 나오는 눈을 말한다. 즉, 줄 기, 잎, 뿌리 등에서 눈이 형성되는 것을 의미한다. 잎, 뿌리, 줄기 등의 절편체로부터 부정아가 형성되는 과정에는 두 가지의 경우가 있다. 첫째는 절편체에서 직접 부정아가 형성되는 경우와 둘째, 절편체에서 callus 가 형성되고 이 callus에서 부정아가 형성되는 경우가 있다.

일반적으로 절편체에서 직접 부정아를 형성하는 식물은 비교적 재생력이 좋은 베고니아, 백합등이 있고, callus 에서 부정아를 형성하는 식물은 비교적 재생력이 낮은 감귤류, 야자 등을 들 수 있다. Callus 세포의 상당 부분은 倍數性(polyploidy)이거나 異數性(aneuploidy)를 나타내기

때문에 callus 과정을 거쳐 나온 식물체들은 본래의 특성과는 다른 식물체가 될 수 있다.

부정아 형성에 영향을 미치는 요인들은 다음과 같다.

 

① 생장조절제

부정아 형성은 주로 auxins 과 cytokinins 의 상호작용에 의해서 이루어지며 식물체에 따라 그 비율이 매우 다양하다.

또한 대부분의 경우 부정아 형성에는 adenine 과 cytokinin을 함께 혼용처리하는 것이 좋다. 물론 베고니아, 담배, 느릅나무 등은 adenine 단독처리로 부정아형성이 잘 된다 Abscisic acid(ABA)는 일반적으로 부정아 형성을 억제하지만 고구마에서는 부정아 형성을 촉진한다. 기내배양시 NAA 첨가, 고온처리, 절편의 상처, TIBA 첨가 등으로 기내의 ethylene 농도가 높아지는데 배양중 ethylene의 농도가 높아지면 백합의 경우에는 자구형성이 높아진다.

이상과 같이 부정아 형성에는 식물에 따라 첨가물질에 대한 반응이 다양하다. 따라서 어떤 식물에서 부정아 형성을 촉진시키고자 할 때는 실험 전에 문헌을 충분히 검토한 후에 배지에 첨가되는 물질을 결정하는 것이 좋다.

 

② 무기영양소 : 목본류에서는 일반적으로 배지내 염농도가 낮을 경우에 부정아 형성이 잘 된다.

 

③ 배양환경 : 일반적으로 광은 부정아 형성을 촉진하고 온도는 고온일 때 부정아 형성이 촉진 되고, 접종시 절편체가 배지에 수평이 되었을 때 부정아 형성이 유리하다.

 

④ 기타 : 어린 식물체는 비교적 쉽게 부정아 형성에 되며 당분은 부정아 형성에 중요한 역할을 한다. 그리고 시클라멘, 느릅나무, 아카시아 나무 등에서 비타민은 부정아 형성에 효과가 있다.

 

4-2. 부정근 형성

생장점배양, 액아배양, 마디배양 등과 부정아 형성 등을 통하여 생산된 식물체들은 발근이 이루어져야 성공적으로 토양에서 생장이 가능하다 하겠다. 부정근 형성에는 부정아 형성과 마찬가지로 식물체의 종 뿐만 아니라 품종에 따라서도 부정근 형성 요구 조건이 각기 다르기 때문에 일반화하여 설명하기에는 어려움이 있으나 다음과 같이 정리하였다.

 

① 식물체의 연령과 발달단계

일반적으로 성숙식물체에서 보다는 미숙식물체에서 부정근의 형성이 잘 되며 개화하는 식물체에서 부정근 형성이 잘 된다.

 

② 절편체의 위치

백합의 인편(bulb scale)배양시 기부의 절편이 끝부분의 절편보다 재생이 잘 된다.

 

③ 식물체의 종과 품종

草本性식물은 木本性 식물보다 재생이 쉽게 된다. 초본성 식물중에서도 때로는 품종이 다르면 재생능력이 달라진다.

 

④ 상처

철쭉류와 사과에서는 상처에 의해서 발근이 촉진 된다.

 

⑤ 접종방향

절편의 방향을 거꾸로 하는 무극성(apolar)으로 접종하면 부정근의 형성이 촉진된다. 이러한 원인은 아마도 기부가 배지위에 노출되어 O2 의 공급이 원활하거나 절편체내 물질의 축척 등과 관계가 있을 것으로 추정하고 있다.

 

⑥ 광

조직배양시 광은 발근에 負의 영향을 갖는데 왜 광이 뿌리형성에 억제효과를 갖는지는 아직 알지 못하고 있다.

 

⑦ 당분

부정근 형성에 꼭 필요한 물질이다.

 

⑧ 무기영양소

부정근 형성에 무기영양소의 영향에 관해서는 별로 알려진 바는 없으나 일반적으로 배지의 무기염류 농도를 낮추면 부정근 형성이 잘 된다.

 

⑨ 생장조절제

Auxins은 부정근 형성을 촉진하나 cytokinins, gibberellins 및 abscisic acid 는 부정근 형성을 억제한다.

 

⑩ 기타

한천, 삼투가(osmotic value), 산(pH)가 뿌리형성에 미치고 영향에 관해서는 별로 알려진 바가 없으나 活性炭(activated charcoal)은 부정근 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

 

5. Callus에서 기관과 배의 형성

Callus는 본래 분화된 조직과 기관의 상처에서 생기는 기관되지 않은 조직이다. 이러한 callus를 적당한 조건에서 배양하면 부정기관이 형성(organ formation, organogenesis)되거나 不定胚 (emborytoid) 즉 胚形成(emboryogenesis)이 일어난다.

 

5-1. Callus의 유도 및 증식

식물의 조직이 상처를 받게 되면 상처부위가 再生(regeneration)되기 위하여 callus 가 형성되는데 이와 같이 이미 분화된 절편체로부터 분화되지 않은 세포로 복귀하는 현상을 脫分化(de-differentiation) 라고 한다. 탈분화는 분리된 절편체의 성숙세포가 어린 상태로 되돌아 가는 回春(rejuvenation)이 일어난다. 회춘된 세포는 성숙세포보다 성장과 분열능력이 더 크며 특수환경하에서 기관(organ)이나 胚(embryo)로 재생할 수 있다.

절편체가 탈분화된 후에는 세포가 배지에 첨가되어 있는 물질의 영향을 받아 활발히 분열되어 callus를 형성하게 된다. Callus의 형성은 외식편(explant)의 채취부위나 시기, 생리적인 상태에 따라 영향을 받는다. 이러한 영향은 주로 內生生長 促進物質이나 內生生長 抑進物質의 함량이 식물조직의 부위 또는 계절적으로 차이가 있기 때문에 나타나는 현상이다.

절편체로부터 callus를 형성시키기 위해서는 생장조절제 뿐만 아니라 배지의 성분, 광, 온도, 식물체의 인자형에 따라 차이가 있으나 일반적으로 생장조절제의 영향이 callus의 유도에 가장 큰 영향을 미친다. 생장조절제의 요구도는 3가지형으로 구분된다. ① Auxin 하나만 필요한 경우 (주로 단자엽 식물), ② cytokinin 하나만 요구하는 경우 ③ auxin과 cytokinin 두 가지를 요구하는 경우가 있다. 배지의 성분으로는 MS배지의 무기성분 또는 MS배지의 변형배지를 이용하고 탄소원으로는 설탕 또는 포도당(2∼4%)을 이용한다. 광은 식물의 종류에 따라 광선을 요구하거나 암흑이 필요한 경우가 있다. 온도는 일반적으로 22∼28℃이나 비교적 고온일 때가 callus형성이 잘 된다.

Callus의 증식은 계대배양을 하여 증식시킨다. 계대배양의 배지는 callus를 유도하였을 때 배지와 유사하다. 계대배양은 고체배지 또는 액체배지에 배양을 한다.

Callus를 장기간 계대배양을 계속하면 分化力이 상실된다. 이는 全形成能(totipotency)을 지니고 있는 세포가 그 기능을 발휘하지 않기 때문이다. 이러한 기능에는 배지조성이나 배양환경 등 여러 요인이 관여되어 있지만 주된 원인은 유전정보나 유전적 정보를 상실함으로써 초래된다.

또한 callus 배양에는 습관성(habituation)이 작용한다. 즉 callus 계대배양을 반복하면 auxin과 cytokinin의 요구성을 잃고 생장조절제에 독립영양성이 되는 현상을 말한다.

 

 

5-2. Callus로부터의 기관의 재생

Callus로부터 부정기관과 체세포 배(somatic embryo)를 유기시킬 수 있다. 여기서는 부정기관의 재생에 대해서 설명하기로 하고 체세포배는 다음의 항목에서 설명할 것이다.

Callus 조직의 재생능력은 이미 앞에서 언급된 것처럼 callus의 계대배양이 계속되면 재생능력이 감소하거나 완전히 소실될 수 있다. 재생능력을 향상시키기 위해서는 여러 요인들이 관계하나 일반적으로 조절제가 주요한 역할을 한다. Callus 조직에서 auxin농도가 cytokinin농도보다 높으면 부정근이 형성될 확률이 높고, 이와 반대로 cytokinin의 농도가 auxin의 농도보다 높으면 부정아가 형성될 확률이 높다. 물론 callus 조직에서 부정아의 유도는 이처럼 간단하지는 않다. 어떤 경우에는 배지의 염(salt)농도가 높을 때, ammonium농도가 높거나 낮을 때 부정아 형성이 잘 되는 경우도 있다.

어쨌든 callus 배양을 통하여 번식을 시키고자 할 때는 다음의 요건을 만족시키는 것이 좋다.

배양절편체에서 callus 형성이 용이하고 형성된 callus를 배양하기 쉬울 것

장기간 계대배양을 한 후에도 식물체로의 재생능력이 높을 것

유전적으로 안정할 것

체세포 유래의 배발생이 가능할 것

 

5-3. 체세포 배형성(Somatic embryogenesis)

胚는 난세포와 정세포의 수정에 의해서 이루어지는 접합자배형성이다. 그러나 체세포배는 체세포나 조직으로부터 배가 재생하는 것을 말한다. 이러한 체세포 배를 배 유사구조, 부정배(adventitious embryo), 영양배, 부정배(embryoid), 無性胚(asexual embryo)라는 용어로 불리운다.

배발생세포의 특성

크기가 작고 조밀한 세포질

비대한 인(nucleolus)을 가진 핵(nucleus)

작은 액포 및 다량의 전분립

RNA합성과 신진대사 활동 활발

 

1)체세포 배형성

직접형성되는 방식

Callus 시기를 거치지 않고 절편조직의 일부에서 단일세포나 일단의 세포로 부터 無性胚(asexual embryo)가 형성되는 것. ex)감귤류(citrus)의 주심조직

간접적인 배형성 방식

절편체에서 callus를 형성시키고 여기서 前胚(proembryo)를 발생시킴

*前胚는 높은 농도의 옥신에서 잘 발생한다.

ex)0.45∼4.52μM 2,4-D

*생장조절제가 없는 배지에 callus를 옮겨서 초기의 proembryo로 부터 雙極性(bipolar)胚가 나 오도록 유도.

 

2)체세포 배의 유도

일반적인 조건

胚의 유도에는 고농도의 auxin 특히 2,4-D가 요구된다.

Giberellima 과 ethylene은 일반적으로 胚形成억제

ABA는 배의 정상적인 성숙을 조장하고 이상배 발생이나 배들 사이의 불균형 발육을 억제해서 마치 수정난에서 생긴 배와 같이 정상이면서도 균일한 배의 集團을 만든다.

幼植물체에서 유기된 callus에서의 胚發生 빈도가 높다

무기물의 영향

N → ammonium ion형태로 적은양 공급

K → 질소가 제한되었을 때 촉진

Ca → 농도가 높으면 배발생 억제

염농도 → 높으면 배발생 촉진

유기물의 영향

야자유- 배양초기에 배발생에 효과적

환경 - 광: 일반적으로 촉진

온도: 고온이 일반적으로 촉진

문제점

배발생 유기가 비교적 어렵다

장기 배양하려면 재생력이 떨어진다

휴면이 발생되는 수가 있다

 

3)체세포배의 특성

체세포배는 callus의 표면이나 배발생 callus로 부터 유래됨

정해진 分節運動의 초기 양상의 부재. 그러나 구상기(globular stage) 이후에는 접합체배와 같은 양상으로 발전한다.

胚柄존재의 불확실

접합체배: 배병은 모체로부터 영양을 공급받는 통로의 역할과 배를 지지하는 역할을 함

체세포 배: 세포소기관(원형질 연결, 미소관 등)에 의하여 영양분 공급

접합체 배: 동일 품종내에서 일정한 형태

체세포 배: 크기와 모양이 다양

휴면성의 불확실

접합체배: 종자의 성숙과 함께 건조상태로 휴면

체세포배: 종자에서와 같이 건조한 상태로 휴면을 할 수 없다

 

4)당근에서 체세포배 유도

① 당근 종자를 1% NaOCl+Tween 20 소독 또는 당근 뿌리 소독

② MS 배지에 種子치상(1000lux, 16시간 일장, 25∼29℃ 배양)

③ 식물체 크기가 1∼3㎝로 자라면 엽병을 1㎝로 자름

④ MS +0.45㎛ 2,4-D, 암흑, 25∼29℃, 4∼8주 배양

⑤ 0.5∼1㎝2의 callus절편을 8주마다 계대배양

⑥ 한천배지에 이식 16시간, 1000lux, 25∼29℃

⑦ 소식물체분리½MS배지에 치상→토양에 이식

⑧ 2∼4g embryogenic callus를 MS + 0.45μM 2,4-D, 50rpm액체 배양

(250㎖삼각플라스크에 25㎖배양)

⑨ 100lux, 16시간, 25∼29℃

⑩ 2주후에 배지 ½를 새로운 배지에 1: 1로 희석

⑪ 2주마다 5㎖현탁액을 20㎖의 새로운 배지에 옮김(1 : 4)

⑫ 배양액을 43∼200μM mesh stainless 망에 여과한 다음에 hormone free MS배지에 계대배양




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