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미생물이야기 체세포 잡종법(somatic hybridization)
2013-08-14 12:27:12
이엠생명과학연구원

체세포잡종 및 유전자조작

 

체세포잡종은 체세포를 대상으로 유전적인 구조가 서로 다른 두 가지의 세포를 융합하거나, 다른 세포의 세포기관이나 유전물질을 이식하여 잡종세포를 만드는 것을 말하고, 이 기법을 체세포 잡종법(somatic hybridization)이라 한다.

유전자조작이란 특정형질(표현형)을 나타나게 하는 물질인 DNA를 조작하는 것으로서 재조합(recombinant DNA)를 만들고 특정 유전자를 한 種에서부터 다른 種으로 이전시키는 방법 즉, 유전자 편집기술을 의미하는 것이다.

 

 

§1. 원형질체 융합에 의한 체세포 잡종

원형질체(protoplast)는 완전한 식물세포에서 세포벽만이 제거된 것이다(세포벽이 없는 세포). 세포벽은 주로 cellulose와 pectin으로 구성되어 있다. 이러한 세포벽을 분해하기 위해서는 cellulase와 pectinase등을 처리하면 된다.

 

1. 원형질체의 분리와 배양

1-1. 표면살균

기내에서 무균적으로 재배된 식물체를 제외하고는 모든 재료는 표면살균되어야 한다. 살균액에 의해서 재료가 상해를 받으면 원형질체의 수율과 활력이 떨어지므로 각별히 조심해야 한다. 기타의 살균방법은 일반 조직 배양에서의 살균방법과 동일하다.

1-2. 절편의 채취

표면살균이 끝난 잎 등을 핀셋을 이용하여 잎의 뒷면에 있는 엽맥을 잡고 표피를 벗긴 뒤 절편체를 잘게 썰어 효소액에 띄운다. 잎이 얇거나 표피를 벗길 수 없는 재료일 때는 약 250mesh정도의 금강사로 재료의 뒷면을 문질러 이용한다.

1-3. 효소의 선택

원형질체를 분리하기 위해서는 주로 효소를 이용한다. 따라서 원형질체를 효과적으로 분리하기 위해서는 농도를 결정하여 사용하는 것이 중요하다. 원형질체를 감싸고 있는 세포벽은 주로 celluose와 pectin으로 구성되어 있으므로 이들을 분해시키기 위해서는 cellulase와 pectinase를 처리하게 되지만 이외에도 hemicellulase 등을 추가로 첨가할 때 원형질체가 분리된다. 작물별로 원형질체 분리에 사용된 효소의 종류, 농도 및 처리조건은  참조하기 바란다.

 

1-4. 효소의 배지

효소처리로 세포막이 파괴되면 팽압에 의해서 원형질체가 파열되므로 이것을 방지하기 위하여 높은 농도의 삼투압 조절제를 첨가한다. 삼투압 조절제로는 glucose, mannitol 및 sorbitol이 있다. 효소의 처리는 일반적으로 세포의 생존력을 떨어뜨리는 효과가 있으므로 가능하면 효소의 처리시간을 짧게 하는 것이 좋다.

효소의 처리시간이 짧으면 효소에 glucosee나 mannitol 등을 첨가하여도 무방하나 처리시간이 길면 무기와 유기 영양분을 모두 갖춘 효소배지(효소액, enzyme solution)가 필요하다. 이때 배지 중에 포함된 영양분들은 세포벽의 분해와는 상관이 없고 단지 원형질체의 생존력을 높이기 위하여 첨가된다.

일반적으로 효소배로는 cell-protoplast washing(CPW)배지에 mannitol이나 sucrose 등을 첨가하여 이용한다. 이들을 첨가할 때는 CPW13M(Mannitol 13%함유) 또는 CPW23S(Sucrose 23%함유)등으로 표시한다.

1-5. 원형질체의 정제

재료를 효소액에 처리 (참조)한 후 용기를 흔들거나 재료를 살짝 눌러 짜서 원형질체가 효소액에 나오도록 한다. 효소액을 60∼70㎛ 공극의 체로 걸러 찌꺼기를 여과한다. 여과물은 CPW액에 재현탁해서 80∼120xg로 3∼10분간 원심분리한다.

원심분리후 상층액을 구멍이 큰 피펫으로 뽑아내고 침전된 pellet은 다시 CPW액에 재현탁하여 원심분리를 2回 더 반복한다. 이와 같이 순수 분리된 원형질체를 형질전환이나 융합에 사용한다. 원형질체를 배양할 때는 haemocytometer로 원형질체 농도를 0.5∼1×105/㎖로 조정한 다음 액체배양, 반고체배양, 간호배양(nurse culture)등이 있다.

 

2. 원형질의 융합

2-1. 자발적인 융합(spontaneous fusion)

원형질체를 만드는 과정에서 세포벽 분해효소의 자극과 삼투압의 변화로 일부 원형질체가 스스로 융합될 수 있다. 이러한 자발적인 융합(spontaneous fusion)은 원형질체를 싸고 있는 plasmalemma를 통해서 연결된 원형질 연락사(plasmodesmata)가 팽창하여 유착될 경우에 일어난다.

이와같이 2개 이상의 같은 원형질체가 융합되면 同種의 핵이 2개 이상 되는 同種核[接合](homokaryon) 또는 동종핵세포(homokaryocyte)라고 한다.

그러나 일반적으로 원형질체의 융합은 다른 원형질체간에 이루어져야 하기 때문에 자발적인 융합(spontaneous fusion) 은 특수한 목적 이외에는 큰 의미가 없다. 따라서 저발적인 융합의 비율이 높으면 이용할 수 있는 원형질체의 수를 감소시키므로 이를(자발적인 융합을)억제시키기 위하여 단일 원형질체 분리액만을 사용하거나 분리시간을 짧게하여 원형질연락사의 열결을 단절시키는 방법이 있다.

2-2. 인위적인 융합

우리의 의도에 따라 異種의 원형질체 간에 융합을 유도하기 위하여 화학물질을 처리하는 방법과 물리적인 방법이 있다.

 

(1)화학물질 유도융합

① 높은 pH와 Ca++ 처리 융합

이 방법은 원형질체가 Ca++ 이온 속에서 서로 응집되는 성질을 이용한 것이다. Keller 와 Melchers(1973)는 담배 원형질체를 융합시키기 위해 높은 pH 하(10.5)에 Ca++ 이온의 영향을 조사한 바 0.4M CaCl2·2H2O의 용액에 원형질체를 넣고 50xg로 30분간 원심분리 후 37℃의 water-bath에 40∼50분간 중탕하였더니 20∼50%가 융합되었다고 한다.

② Polyethylene glycol (PEG) 처리 융합

이 방법은 대부분의 세포에 독성이 낮고 이핵배합체(heterokaryon)의 형성율이 높다. 유연관계가 전혀 없는 식물 사이에서도 많이 이용된다. 그 예로 콩과 담배, 콩과 옥수수,콩과 보리사이 뿐만 아니라 동물과 동물, 심지어는 동물과 식물사이에서도 융합이 이루어진다.

③ PEG와 Ca++ 처리 융합

PEG처리시 Ca++ 를 첨가하면 효과가 있다.

④ PEG처리 융합시 일반적으로 융합산물이 용기의 표면 부근에 수 일동안 떠 있어서 융합이 확인될 때에 이들을 즉시 분리하는 데 어려움이 있다. Menczel and Wolfe (1984)는 이를 개선하기 위해 PEGD 와 DMSO를 함께 사용함으로써 개체별 융합산물을 쉽게 분리하였다고 한다.


 

(2) 물리리적인 유도방법

물리적인 유도 방법으로는 전기유도 융합 방법과 최근에 현미경과 microneedle를 이용하여 직접 융합시키는 방법등이 있다. 그러나 후자의 방법은 본인이 직접적으로 접한바가 없어 전기유도 융합방법에 관하여서만 설명하고자 한다.

전기유도 융합방법

◎ 기구의 구조와 기능

원형질체가 알맞은 電界 (electric field)에 놓이면 전기적인 자극에 의해 즉시 융합된다. 이것은 화학물질을 매개로한 융합보다 독성이 없고 조작이 용이하며 단시간(약 10분)에 이루어지기 때문에 널리 이용된다. Zimmermann and Scheurich(1981)가 개발한 전기유도 융합장치의 기본구조와 융합이 이루어지는 과정를 눌러 참조하기 바란다. 처음 이 방법이 소개된이후 약간씩 변형되어 직류뿐만 아니라 교류 및 전압강도를 조절하여 융합시키는 방법등이 개발되었다.

융합에 미치는 조건

원형질체가 전기적인 힘에 의해서 융합이 유도될 때 영향을 받을 수 있는 조건은 크게 두가지가 있다. 하나는 전기적인 조건이고 다른하나는 원형질 자체의 조건이다.

 

3. 잡종세포의 선발

A와B 식물의 원형질체를 융합하고자 할 때 융합은 A와B 뿐만 아니라 A와A, B와B 사이에서도 이루어진다. 따라서 원형질체 융합후 우리가 원하는 융합체를 선발하는 것이 가장 큰 문제점이다. 지금까지 시도되었던 방법에 관하여 간단하게 언급하고자 한다.

① 흡입식 선발

피펫이나 스포이드 (직경 1.5∼2mm)를 불로 늘려 입구의 지름이 0.1∼0.2mm정도인 미세피펫을 이용하여 융합된 원형질체를 흡입하여 선발하는 방법이다. 이방법을 이용하기 위해서는 융합체내의 엽록체,전분립 또는 색소체같은 외형적으로 구분이 뚜렵한 표지(marker)가 있어야 한다.

② 형광물질이용

두가지 원형질체에 각각 다른 형광물질을 처리하여 융합된 원형질체를 세포분류기를 이용하여 융합된 세포를 선발하는 것이다.

③ 백화 돌연변이체 이용

자연적 또는 인위적으로 만든 돌연변이체를 이용하여 융합된 세포를 선발하는 것이다.

④기타 방법

교배친의 특성에 따라 융합체를 선발한다. 예로써 융합된 원형질체에서 잡종강세 (hybrid vigour)가 나타나서 이융합세포보다 월등히 생장하므로 선발이 가능하다. 이 이외에 형질전환된 세포를 이용하는 방법등도 있다.

4. 원형질체 융합의 육종적 이용

① 불임식물체의 잡종생산

반수체, 3배체 혹은 기타 이수체나 유성적으로 교잡이 이루어지지 않는 불임식물체는 원형질체 융합에 의해서 잡종식물체를 만들 수 있다.

② 불화성의 회피

인연이 멀어서 유성적으로 교잡이 안 되는 다른 속(屬), 種, 科 간의 교잡을 가능하게 함으로써 새로운 식물의 種을 창조할 수 있다.

③ 세포질의 이식

유성적인 잡종에서는 부친쪽에서 염색체 유전자(chromosomal gene)만이 교잡에 참여하고 엽록체와 미토콘드리아에 존재하는 세포질 유전자(cutoplasmisc gene)는 제외 되지만 체세포잡종에서는 이들을 모두 이용할 수 있으므로 세포질적 웅성불임인 계통의 형질을 이용할 수 있다. 또한 세포질의 유전자 중에는 광합성율,내병성 및 제초제 저항성 등도 포함되어 있어 이를 이용할 수 있다.

④ 발육단계와 상관없이 교잡이 가능

유성적인 잡종에서는 개화된 식물체 사이에서만 교잡이 가능하나 원형질체 융합시에는 모든 식물체의 발육단계에서 서로 교잡이 가능하다.

 

§2. 유전자 조작에 의한 식물체의 형질전환

형질전환(transformation)은 외래의 유전자나 세포기관을 다른 세포로 옮겨서 이들이 그 곳에서 발현되도록 유도하는 것이다. 본 절에서는 유전자 조작에 의한 형질전환에 관하여 논의할 것이다.

유전자 조작은 동물,식물,미생물에 걸쳐 광범위하게 적용된다. 특히 식물체는 재분화가 가능하고, 동물보다 취급이 쉬우며, 형질전환에 대한 사회윤리적 제약이 상대적으로 적으므로 발전의 여지가 훨씬 크다 할 수 있다. 식물의 유전자 조작에 대한 형질전환을 성공시키기 위해서는 다음의 4가지 조건이 충족 되어야 한다. 즉 유용유전자의 선정 및 분류법,분리된 clone의 유전자조작법,유전자의 식물세포내로의 도입방법,형질전환체의 선발 및 재분화법의 확립이다.

 

1. 유용유전자의 선정 및 분리

지난 10년간 유전자 cloning 및 확인 기술은 장족의 발전을 보았고 식물유전자도 다수 연구되었다. 현재까지 유전자를 분리하는 데는 주로 다음 두가지방법이 사용되었다. ① 단백질의 생화학적 특성연구에 근거하여 항체와 합성염기서열을 만들고 이들을 유전자 clone의 선발에 사용하거나 ② 선별적으로 발현되는 유전자를 찾아내기 위하여 differential hybridization 방법을 사용해 왔다.

그러나 이 방법들은 특정 유전자의 산물인 특정 단백질을 먼저 생화학적으로 규명해야만 가능하고 그 방법 자체가 예민하지 못하다는 단점을 가지고 있다.

따라서 앞으로는 유전자 표지법(gene tagging)이나 chromosome walking 같은 유전학적 방법을 써서 표현형에 근거한 식물유전자 분리법이 많이 개발될 전망이다.

현 단계에서 식물형질전환은 유용유전자의 분리가 가장 큰 걸림돌이며, 이 문제의 궁극적인 해결은 genome project에서 찾게 될것이나 그 중간 과정에서는 restriction fragment length polymorphism(RFLP) 지도 작성과 chromosme walking등의 방법이 동원 될 것이다. 미국의 공식적인 RFLP 지도작성 사업은 옥수수 (17개 연구프로젝트), 콩(14), 토마토(9), 밀(8), 보리(7), 벼(6), 소나무(6), 감자(4), 잠두(4), 수수(3), 알팔파(3)에서 반복 염기서열이 적으며, 한 세대의 기 간이 짧고, 종자수가 많은 등 여러 가지 장점 때문에 식물 genome 지도작성의 모델 체계로 발 전되고 있다. 또한 옥수수에서는 900개의 표지가 지도화 되었고 벼는 250개의 표지가 지도화 되었다.

 

2. 유용유전자의 식물체로의 도입방법

식물체에 외부유전자를 도입하는 방법은 다음 3가지로 나누어 설명할 수 있다.

2-1. Aglobacterium을 이용하는 방법

A. tumefaciens를 이용한 형질 전환기술은 쌍떡잎식물에 외부 유전자를 도입하는데 가장 널리 이용되고 있다.

2-2. Virus vector를 이용한 방법

현재 많이 이용되고 있는 Virus vector는 cauliflower mosaic virus(CaMV) vector와 genini virus vector 이다.

2-3. 유전자 직접전입법(direct gene transfer method)

유전자 직접주입법은 식물세포의 원형질이나 핵으로 외부 유전자를 직접 넣어 이것이 식물체 주염색체내로 삽입되게 하는 방법이다. 가장 간단한 방법은 화학적, 전기적 방법으로 식물세포막에 일시적으로 공극을 형성시킨 다음 이를 통해 외부 유전자를 도입하는 것이다. 이러한 방법의 대표적인 예가 electroporation 방법이다. 이 보다 더 적극적인 방법은 particle gun에 의한 DNA bombardment method 이다. 즉, Tungsten 입자로 DNA를 coating 하여 이 입자를 particle gun 으로 쏘아 식물체내로 주입시키는 방법이다. 이 외에도 유리 모세관을 이용한 microinjection 방법과 microlaser를 이용하는 방법등이 있다.




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