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미생물이야기 유전자 치료를 위한 벡터 시스템에 대해 알아보자.
2013-08-14 12:33:23
이엠생명과학연구원

유전자 치료를 위한 벡터 시스템

 

사람을 대상으로 한 유전자 치료는 생식세포가 아닌 체세포만을 대상으로 이루어지고 있으며(somatic gene therapy), 유전자 치료법이 성공하기 위해 가장 중요한 문제는 효율적인 유전자 전달 방법의 개발과 지속적인 유전자 발현이다.

유전자 전달 방법을 구분 짓는 한가지 특징은 전달된 유전자가 목적 세포의 염색체내로 삽입되는지의 여부와 관계 있다. 예를 들어 만약 치료 유전자를 bone marrow stem cell로 전달하고자 할 경우 전달 유전자를 염색체내로 안정하게 삽입할 수 있는 방법을 택해야 stem cell이 분화하고 증식함에 따라 희석되지 않고 그 자손 세포들로 고르게 전달될 수 있을 것이다. 반면 분화가 끝나 더 이상 분열하지 않는 골격근과 같은 세포로 유전자 전달을 하고자 할 경우 꼭 치료 유전자가 염색체내로 삽입되어야 할 필요는 없을 것이다.

유전자를 세포 내로 전달하기 위한 벡터는 크게 비 바이러스성 벡터와 바이러스 벡터의 두 영역으로 나눈다. 비 바이러스성 벡터는 DNA의 직접 주사법을 비롯하여 DNA와 polylysine 혹은 양성 지질과의 혼합물을 이용하는 방법들을 망라한다. 이들 대부분의 방법은 낮은 유전자 전달 효율과 일시적인 유전자 발현의 단점을 갖는다. 최근의 대부분의 유전자 치료는 두 번째 범주인 바이러스 벡터를 이용하고 있으며, 이때 사용되는 바이러스는 어떠한 병원성도 없는 결함 바이러스이다. 바이러스는 그들의 유전물질을 숙주 세포 내로 전달할 수 있도록 수억 년 동안 진화되어 왔으므로 이들 바이러스를 유전자 전달 매개체로 사용하는 것은 상당히 강력한 기술임에는 틀림없으나, 인간 또한 외부로부터 유입된 물질을 제거하기 위한 방어 기전을 가지고 있기 때문에, 바이러스 벡터에 있는 유전자를 전달하기 위한 노력들도 이들 숙주세포의 면역 반응으로 인해 어려움에 직면하여 왔다.

일단 벡터가 결정되고 나면 유전자 전달에 두 가지 일반적인 접근법이 쓰일 수 있는데, 환자로부터 세포를 분리하여 유전적으로 변형한 뒤 다시 재이식하는 ex vivo 방법과 재조합 유전물을 직접 환자에게 투여하는 in vivo 치료법이다. ex vivo법에 비해 in vivo방법이 간단하여 선호되는 방법이기는 하나 현재 기술로는 비효율적이며, 임상 시험에는 ex vivo 방법이 흔히 쓰여왔다. 그러나 ex vivo 방법은 신체로부터 분리가 가능하고, 유전적으로 변화가 가능하며, 다시 이식되었을 때 오랜 기간 생존이 가능한 세포들을 이용한다. 예를 들면 조혈세포는 이에 적합하나, 신장, 뇌 등 신체의 대부분의 조직들과 개개의 세포들은 실험실에서 효율적이고 안정한 유전자 전달을 할 수 있을 만큼 다량으로 단시간 동안 배양할 수가 없으며, 섬유아세포나 간장세포의 경우 대개 재이식된 세포들이 오래 생존하지 못한다. 이러한 제한으로 인해 ex vivo 유전자 전달은 주로 조혈세포, 내피세포 그리고 암세포 등에만 적용되고 있다.

 

1) 재조합 바이러스 벡터(Recombinant Viral Vectors)

 

(1) 레트로바이러스 벡터

레트로바이러스는 감염된 세포에서 RNA 게놈이 DNA로 전환되어 숙주세포의 염색체내로 삽입되는 일련의 바이러스 군으로, 현재까지 Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)에 기초한 레트로바이러스 벡터가 각종 유전자 치료를 위한 임상 시험에 가장 널리 사용되고 있다.

 

① 구조 및 특징

레트로바이러스 입자는 2가닥의 RNA를 포함하는 단백질 core가 지질 외막에 의해 돌러 싸인 형태를 하고 있다. 레트로바이러스의 생활사는 외막 단백질이 세포 표면의 특정 수용체와 결합함으로써 시작되는데, 동물 세포에 감염할 수 있는 ecotropic 외막의 경우 그 수용체는 cationic amino acid transporter이며, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 MoMLV amphotropic 외막의 수용체는 phosphate transporter (Ram-1)로 알려져 있다. 바이러스와 세포막간의 융합 혹은 세포흡수작용에 의해 바이러스는 세포내로 도입되고 바이러스의 RNA는 역전사과정에 의해 DNA로 전환되어 핵으로 이동한다. 대부분의 레트로바이러스는 이 DNA가 핵속으로 들어가기 위해 유사 분열과 그에 따른 핵막의 파괴를 필요로 하며, 핵내에서 DNA는 염색체내로 삽입되어 provirus를 형성한다. 삽입된 provirus에서 전사된 RNA로부터 gag, pol, env 유전자 산물이 합성되고 이들은 게놈 크기의 바이러스 RNA만을 포장하여 바이러스 입자를 생산하게 된다.

MoMLV 게놈은 8264 bp의 크기를 가지며 모든 레트로바이러스와 마찬가지로 gag, pol, env의 단백질 코딩 부위가 5′, 3′끝에 존재하는 LTR내에 포함되어 있다. LTR은 게놈의 삽입과 전사 조절에 필요한 염기서열을 포함하고 있으며, 5′LTR 바로 뒤에는 tRNA primer가 결합하여 역전사가 시작되는 -P 부위가 있으며, 그 하류의 splice donor (SD)는 subgenomic 외막 mRNA 생산에 이용된다. SD와 gag 유전자 사이의 psi(φ)서열은 게놈 RNA의 encapsidation에 필요하다. 바이러스의 복제와 포장에 요구되는 단백질들은 gag, pol, env 세 유전자의 산물이며, env 유전자의 끝과 3′LTR 사이에 존재하는 purine rich 부위는 +strand cDNA 합성이 시작되는 부위(+P)이다.

 

② 장점 및 단점

레트로바이러스 벡터는 in vitro에서 쉽게 조작이 가능하며 유전자 전달이 효율적이고 유전자가 숙주세포의 염색체내로 안정하게 삽입되어 지속적으로 자손세포에 전달될 수 있다는 장점을 지니는데, 이는 유전질환에 대한 유전자 치료에 매우 중요한 특성이다. 그러나 레트로바이러스는 분열하는 세포에만 감염될 수 있으며 다른 DNA 바이러스벡터에 비해 낮은 역가로 생산되기 때문에 ex vivo로만 적용될 수 있다. 또한 숙주세포 염색체내로 무작위 삽입된다는 단점을 갖는데 이는 각각의 세포에서 레트로바이러스 벡터가 삽입되는 위치에 따라 유전자 발현이 다를 수 있음을 의미한다.

 

(2) 아데노바이러스 벡터

아데노바이러스는 선형 이중 가닥의 DNA를 게놈으로 갖는 nonenveloped 바이러스로 subgroup C adenovirus (Ad2, Ad5)는 주로 사람의 upper respiratory tract에 감염하여 경미한 호흡기 감염의 원인이 된다. 아데노바이러스는 분열하는 세포 뿐 아니라 분열하지 않는 세포 모두에 감염 가능하며, 일반적으로 숙주 염색체 내로 삽입되지 않고, 대신 핵 내에서 episomal element로 복제된다.

 

① 구조 및 특징

Ad5의 게놈은 36kb의 직선형 이중가닥 DNA로 8개의 전사 단위로 구성되어 있는데 조절 단백질을 발현하는 초기 유전자(early gene)와 구조 단백질을 발현하는 말기 유전자(late gene)로 나뉜다. 염색체 양 말단에는 말단 반복 염기서열(inverted terminal repeats ; ITR)이 있어서 복제 개시 부위의 역할을 하며, 왼쪽 ITR에 뒤이어 바이러스 게놈의 포장에 관여하는 φ염기서열이 존재한다. 아데노바이러스는 매우 높은 농도로 얻을 수 있고 분화가 끝나 분열하지 않는 세포에도 효과적으로 감염할 수 있는 능력 때문에 상당히 매력적인 유전자 치료 벡터로 간주되고 있다.

 

② 장점 및 단점

아데노바이러스 벡터는 유전자 전달효율이 높다는 점과 세포의 분열상태와 무관하게 유전자 발현이 가능하고 상당히 농축된 바이러스를 얻을 수 있기 때문에 많은 세포로 감염가능한 장점을 가지고 있으나, 거의 세포에 감염이 가능하기 때문에 주변의 정상세포에 독성을 나타낼 수 있으며, 숙주 염색체내로 삽입되지 않아 장기간의 유전자 발현이 불가능하다는 단점을 가지고 있다. 아데노바이러스 벡터가 가지는 또 한가지의 단점은 대부분의 사람들이 이미 자연에 존재하는 아데노바이러스에 노출되어 그에 대한 항체를 가지고 있을 것이라는 점이다. 그러나 아데노바이러스 벡터는 외부 유전자의 발현이 단기간 동안만 요구될 때 특히 유용하게 사용될 수 있는데, 한가지 유망한 사용방법은 세포사를 촉진하는 유전자나 면역반응을 조절하는 유전자를 암세포에 전달하는 것으로 이 경우 바이러스에 대한 숙주의 면역반응은 오히려 암세포의 파괴를 촉진 할 수도 있을 것으로 기대된다.

 

(3) 아데노부속 바이러스(Adeno-associated Virus)벡터

① 구조 및 특징

아데노부속 바이러스는 parvovirus에 속하는 단일 가닥의 DNA 바이러스로서 단독으로 복제를 할 수 없으며 아데노바이러스나 백시니아(vaccinia), 혹은 헤르페스바이러스(herpesvirus) 등의 helper 바이러스와 함께 감염되었을 때 복제, 증식할 수 있는 결함 바이러스이다. helper 바이러스가 없을 때 아데노부속 바이러스 게놈은 사람 세포의 19번 염색체의 특정 부위 내로 삽입되어 잠복 상태로 남아 있다가 helper 바이러스가 감염되면 복제, 증식이 가능하게 된다. 아데노부속 바이러스 게놈은 4681 bp의 DNA로, 양 끝에 145 bp의 ITR을 갖는데, 이는 복제와 포장 그리고 rescue에 요구되는 최소 염기 서열이다. ITR 내부에는 2개의 ORF이 있는데, 이는 복제에 요구되는 rep, 그리고 구조 단백질을 코딩하는 cap 유전자이다. 아데노부속 바이러스는 사람 세포에 잠복 감염이 가능하여, 염색체내로의 삽입이 세포 성장에 어떠한 변화도 야기하지 않으며, 다양한 세포에 효율적으로 감염할 수 있고, 아데노바이러스처럼 면역 반응을 유도하지 않는 특성 때문에 유전자 치료에 적합한 벡터 시스템으로 여겨지고 있다.

최초의 재조합 아데노부속 바이러스 벡터는 cap 유전자를 제거하고 외래 유전자를 삽입함으로써 제조되었고, 보다 개선된 벡터는 rep 유전자와 cap 유전자가 모두 외래유전자로 대치된 형태이다. 이는 rep, cap 단백질을 발현할 수 있는 포장 플라스미드가 만들어짐으로써 가능케 되었고, 이 경우 포장 플라스미드와 벡터와의 homology를 최소화함으로써 재조합에 의한 야생형 바이러스의 형성을 방지할 수 있다.

 

② 장점 및 단점

이 벡터 개발에 있어서 주된 한계점은 포장 할 수 있는 유전자의 크기 제한으로 4kb 미만의 외래유전자만이 사용될 수 있으며, 벡터 제조가 어렵고, 그 제조에 많은 노동력을 필요로 하며, 포장 세포주가 없고, 재조합 벡터의 경우 염색체의 특정 위치에 삽입되는 능력을 잃을 수 있다.는 점과 분열하지 않는 세포에 삽입될 확률이 야생형에 비해 크게 낮아진다는 것이다. 최근의 동물 시험에서 아데노부속 바이러스는 삽입되거나 episomal한 두 가지 형태로 모두 오랜동안 존속 가능함이 보여졌으며, 벡터 디자인과 생산 방법에 기술적인 진보가 이루어질 때 본격적으로 임상 시험에 사용될 수 있을 것으로 보인다.

 

(4) 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 벡터

① 특징

헤르페스 심플렉스 바이러스는 용균성(lytic) DNA 바이러스로 중추신경계에 선택적으로 감염하고 신경세포에 일생동안 잠복 감염할 수 있다는 독특한 특징을 가지고 있기 때문에 Parkinson's disease(tyrosine hydroxylase gene), Alzheimer's disease(nerve growth factor gene)과 같은 신경성 질환의 치료를 목적으로 개발되고 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스가 임상 시험에 사용되기 위해서는 잠복 감염의 능력은 유지하면서 용균소 생성 능력이 제거되고, 자가 복제 할 수 없도록 제조되어야 하는데, 헤르페스 심플렉스 바이러스는 70개가 넘는 유전자를 가지고 있는 매우 복잡한 바이러스이기 때문에 이는 결코 단순한 작업이 아니다. 최근까지 thymidine kinase, ribonuclease reductase를 비롯한 여러 바이러스 유전자들이 제거된 벡터가 제조되었고 이 경우 세포 병리 현상이 급격히 완화됨이 보고되었다.

 

② 장점

헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터는 또한 중추신경계 암세포의 선택적인 파괴를 위한 벡터 시스템으로도 사용될 수 있으며, 따라서 보다 안전한 벡터가 개발된다면 신경계와 관련된 질병을 치료할 수 있는 주요한 유전자 전달법이 될 수 있을 것이다.

 

(5) 폭스바이러스(Poxvirus) 벡터

① 특징

폭스바이러스에 속하는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 천연두 예방을 위해 사용되는 백신으로 최근에는 유전자 재조합 기술을 이용하여 유전자 전달 벡터로 개발되고 있다. 폭스바이러스는 이중 가닥의 DNA virus로 아주 낮은 확률로 염색체내로 삽입되고, 복제는 세포질에서 수행된다. 바이러스의 표면에 암 항원이나 다른 외부 항원을 동시에 발현시킴으로써 외부 물질에 대한 면역 반응을 향상시키는 것이 가능한데, 이의 한 예로 human carcinoma embryonic antigen (CEA)를 발현하는 카나리폭스(canarypox) 바이러스 DNA 플라스미드를 결장암을 가진 환자에게 투여하여 CEA를 발현하는 암세포에 대해 항암 면역성을 유도하려는 시도가 이루어졌다.

 

② 장점 및 단점

주요 장점은 MoMLV에 비해 4∼5배 이상 큰 유전자를 포함할 수 있으며, 열에 안정하고 다양한 세포에 감염 가능하다는 것이다. 또한, 백시니아 바이러스는 효과적인 면역반응을 유도할 수 있기 때문에 백신 벡터로 사용하기에 이상적인 바이러스로 고려되고 있으나, 현재 천연두에 대한 백신을 받은 경험이 없는 사람에게만 제한되어 사용될 수 있다. 카나리폭스 바이러스는 일반적인 백시니아 바이러스보다 안전할 것으로 기대된다.

 

(6) 렌티바이러스(Lentivirus)벡터

레트로바이러스의 일종인 렌티바이러스는 현재 유전자 전달 벡터로 광범위하게 쓰이고 있지는 않으나 일반적인 레트로바이러스와는 달리 분열하는 세포 뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포에도 감염할 수 있다는 특성 때문에 유전자 전달 벡터로 개발되고 있다. 그 대표적인 예가 HIV인데, 이는 gag, pol, env 외에도 6개의 accessary 유전자을 더 포함하고 있다. 몇몇 accessary 유전자를 제거한 HIV 벡터의 경우 VSV 외막 단백질로 pseudotyping 되었을 때 동물시험에서 뇌, 간, 근육 세포등 광범위한 세포로 감염할 수 있고, 6개월 이상 지속적인 유전자 발현을 유도할 수 있음이 보고된 바 있다. 따라서 현재 보다 안전한 HIV, 혹은 다른 Lentivirus 벡터를 개발하여 이를 분화가 끝난 신경 세포로의 유전자 전달을 위한 시스템으로 사용하고자 하는 노력들이 진행중이다.

 

2) 비 바이러스성 벡터(Non-viral vectors)

 

(1) 구조 및 특징

양성 리포좀은 일반적으로 양성 amphiphile과 중성 helper 지질인 DOPE로 구성되어 있으며, DOPE는 양성 지질이 안정한 리포좀을 형성할 수 있도록 도와준다. 양성지질로는 주로 콜레스테롤 유도체나 lipopolylycine 혹은 double-chain cationic surfactant가 사용되고 있다. 리포좀-DNA 복합체는 + 전하를 띠고 있기 때문에 - 전하를 띠고 있는 세포 표면에 결합하여 세포흡수작용에 의해 세포내로 유입되는 것으로 보인다. 이 밖에도 DNA를 금 입자로 코팅하여 세포내로 주입하는 particle bombardment 방법이 동물 시험에서 성공적으로 사용되었으며, naked DNA를 주사해서 직접 특정 조직에 찌르거나, 혈관을 통해 주입하거나, 또는 catheter를 통해 내피세포로 전달하는 방법 등도 사용되고 있다.

 

(2) 장점 및 단점

바이러스 벡터와 비교해서 양성지질로 DNA를 코팅하여 전달하는 방법은 여러 장점을 갖는다. 바이러스 벡터와 달리 DNA/지질 복합체는 준비하기에 편리하며, 전달될 유전자의 크기 제한이 없다. 또 전달물질이 단백질을 포함하고 있지 않기 때문에 면역 반응을 유도하지 않으며, 자기 복제나 재조합의 가능성이 거의 없어 그에 따른 부작용을 배제할 수 있다는 점이다.

그러나, 이들 방법은 여러 장점에도 불구하고 유전자 전달의 낮은 효율과 유전자 발현이 일시적이라는 단점 때문에 많은 개선의 여지가 있으나, 일시적인 유전자 발현만이 요구되는 경우 실제 임상 시험에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.




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