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미생물이야기 미생물을 이용한 검사법, 면역화학검사법 및 기기분석학적 정량법
2013-08-14 14:56:17
이엠생명과학연구원

항균물질 검사

 

 

우유의 항균물질 잔류의 문제는 식품의 안정성 차원에서 국민의 관심의 대상이 되어 왔다. 낙농식품의 생산에서부터 가공처리 및 유통과정에 이르는 모든 단계에서 위생과 안정성을 보장하는 것이 축산식품을 소비자로부터 외면당하지 않고 신뢰도와 선호도를 높일 수 있는 유일한 방법일 것이다.

미국에서는 최근 항균물질 검사를 강화하여 유가공 회사에서는 우유를 가공하기전 베타-락탐계 항생물질 잔류검사는 의무적으로, 기타 항균물질은 6개월내 4회 이상 실시토록 하고 있다. 양성인 집유차량에 대한 확인검사는 주정부관할하에 수행하고 있다. 잔류 위반 목장을 추적하여 해당목장에 대하여는 음성이 될 때까지 납유를 정지시킨다. Grade A우유 생산목장에 대하여는 2일간 자격을 박탈하고 연속 2회 위반할 경우에는 4일간, 연속 3회일 경우에는 원유생산자격을 박탈하기까지 한다. 베타-락탐계 이외의 항균물질에 대하여는 FDA가 별도로 5,000개의 시료에 대해 종류별로 검사를 수행한다. EU에서는 2000년 이후 부터 최대 잔류허용수준을 결정 실시하도록 되어있고, 독일은 400~500여 무작위 시료를 검사하여 양성인 시료는 최대 잔류허용수준 위반 여부까지 확인검사를 한다.

우유증 잔류 항균물질 검사방법으로는 1차 스크리닝 목적으로 실시하는 검사와 항균물질별 확인 정량분석등이 있다. 그 방법을 검사원리에 따라 분류 해보면 미생물을 이용한 검사법, 면역화학검사법 및 기기분석학적 정량법으로 나누어 볼 수 있다.

 

미생물을 이용한 검사법

 

이 방법은 항균물질들이 시험균주의 성장과 발육을 억제하는 특성을 근거를 기초한 것으로서, 미생물 검사법중 색소환원시험법과 같은 방법이나 결과의 판정법이 반대인 시험법이다. 이 방법은 검사비용이 저렴하고 특별한 검사장비가 필요치 않으나, 검출이 가능한 항균물질의 종류가 제한적이거나 검출감도가 낮은 단점이 있다[표 1][표 2]. 1976년 부터 우리나라에서는 원유중 항균물질 및 세균발육 억제물질 함량을 검사하는 공정분석법으로서 TTC방법이 채택되어 왔다. 미국, EU등 선진 낙농국에서도 아직 이 검사법을 공정검사방법으로 인정하고 있다. 현행의 TTC법은 베타-락탐계 항생물질에 대해서는 0.024ppm 수준까지 검출이 가능하나, 설파제에 대해서는 검출감도가 500~5,000ppm으로 원유에 미량으로 존재할 경우 검출할 수 없다. 이 점을 개선한 방법이 TTC II방법이다. 우리나라에서 실시하고 있는 TTC II방법은 잔류설파제 함량을 25-50ppb수준까지 검출해 낼 수 있으며, 페니실린도 검출감도를 0.024ppm에서 0.005ppm으로 높였으며, 두 항균물질의 종류도 구별이 가능하도록 개선하였다.

 

표 1 낙농국가에서 채택하고 있는 항균물질 공정 검사법

국가별

검사방법

비고

미국

독일

네덜란드

일본

BsDA 법

BBRT 법

BsTD 법

TTC법

미생물 디스크시험법

색소환원법

색소환원법

색소환원법

 

 

 

표 2 미생물을 이용한 검사방법의 비교

검사방법          원리           검출 항균물질           검사시간         검사비용       대상시료

Disc assay    억제환         페니실린                   4시간/64℃    50원/개         우유

TTC               색소환원     페니실린                   3.5시간/37℃ 10원               우유

Delvo sp        색소환원      베타-락탐계, 설파제  3.5시간/64℃ 2,000원         우유,유제품, 뇨,육즙,혈청

BR test          색소환원      모든 항균제               64℃/4시간                        우유 및 액상유제품

Charm AIM    색소환원      베타-락탐계,설파제    5시간/64℃ 1,500원            우유

 

(농림수산부 고시 제1996-46호(96.7.12), 방부제 및 세균발육억제물질검사법)

 

 

 

1. 개량 TTC-II법

 

현행의 TTC법은 베타-락탐계 항생물질에 대해서는 0.024ppm 수준까지 검출이 가능하나 설파제에 대해서는 검출감도가 500-5m000ppm으로 원유에 미량으로 존재할 경우 검출할 수 없다. 이 점을 개선한 방법이 TTC II방법이다. TTC II방법은 잔류설파제 함량을 25-50ppb수준까지 검출해 낼 수 있으며, 페니실린도 검출감도를 0.024ppm에서 0.005ppm으로 높였으며, 두 항균물질의 종류도 구별이 가능하도록 개선하였다.

 

시약

1) TTC용액 : 멸균증류수로 4% TTC용액을 만들어 7℃의 냉암소에 보관하고 2주일 이 내에 사용한다.

2) TMP용액 : 메칠알콜 10ml에 TMP 50mg을 용해하여 100ml용량플라스크의 눈금표시 선 까지 멸균 증류수를 채운다. 이를 다시 1/10 희석하여 (50ug/ml) 실온에서 보존, 2주 이내에 사용한다.

3) PABA용액 : 멸균 증류수에 PABA 500mg을 용해시키고 100ml용량 플라스크의 눈금 표시선까지 멸균증류수로 맞춘다. 이를 1/10 희석하여 (500ug/ml)실온보관, 2주 이내 에 사용한다.

4) Penicillinase : Sigma사 제품(1,000 units)을 멸균증류수 1 ml에 용해한다.

5) 공시균주 및 시험용 배양균액 의 제조 : Streptococcus thermophilus ATCC 14485를 항균물질이 함유되지 않은 10% 멸균탈지유에 접종, 37℃에서 12시간 배양한다. 이를 신선한 10% 멸균 탈지유와 1:1로 혼합하여 즉시 사용한다

 

1. Screening법

 

가. 멸균 캡 튜브를 zero control, TMP control 및 시료를 구분하여 표기한다.

나. Zero 및 TMP control에는 항균물질 없는 우유 8 ml, 시료용 튜브에는 우유 시료를 8ml씩 넣는다.

다. Zero control에는 멸균증류수 1 ml, TMP control 및 시료우유 튜브에는 TMP용액을 1 ml씩 첨가한다.

라. 82℃의 항온수조에서 2.5분간 가열, 측시 37℃이하로 냉각한다.

마. 1:1희석한 시험균액을 1 ml씩 접종, 혼합하고 37℃에서 2시간 배양한다.

바. 0.3ml의 TTC용액을 첨가한 후 37℃에서 30-60분간 반응시킨다.

 

판정

TMP control의 색상을 기준으로하여 기준색상 (도홍색) 보다 옅으면 양성, 같거나 진하면 음성으로 판정한다. 양성인 경우 확인시험을 한다.

 

2. 설파제 및 페니실린제 항생물질 확인시험

 

가. TMP tube, PABA tube, 및 Penase tube를 준비한다.

나. 양성인 시료를 각각 8 ml씩 넣는다 (Zero, TMP control 시료는 항생물질 무함유 우 유를 첨가한다).

다. TMP. Penase 튜브에는 TMP용액 1 ml씩, PABA용액에는 PABA용액 1ml를 넣는다.

라. 82℃ 항온수조에서 2.5분간 가열후 37℃로 즉시 냉각한다.

마. Penase튜브에는 penicillinase 100ul를 첨가한다.

바. 시험용 배양균액을 각각 1 l씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양한다.

사. 300ul의 TTC용액을 첨가하여 37℃에서 30-60분간 배양한다.

 

판정 기준

TMP tubePenase tubePABA tube 결과판정

음성 음성 음성음성

양성 양성 음성설파제

양성 음성 양성페니실린제

양성 양성 양성설파제+페니실린제

 

2. 킷트 검사법

 

위의 방법중 몇가지는 검사 킷트화하여 목장, 집유장 및 검사기관에서 손쉽게 실시할 수 있어 원유의 품질관리에 널리 사용되고 있다.

 

2-1 Delvo 검사법

 

 

                       1) Nutrient tablet을 앰퓰속에 용해      (2) 우유 0.1ml 주입

 

 

                                                                                 변색(음성) 부분변색(음성) 무변색(양성)

                       (3) 64℃로 예열된 히터                          (4) 2시간 30분 반응 결과

 

그림 1 사진으로 보는 Delvo 시험방법

 

2-2 Penzyme법

 

베타-락탐계 항생물질과 쉽게 반응하여 안정한 복합물을 형성하는 합성물질인 R-D-Ala-D-Ala를 가수분해하는 효소 (DD-carboxypeptidase)의 작용을 기초로 한다.

일정량의 효소를 항균물질이 함유된 우유에 넣어서 예비배양하면 항균물질의 양에 따라서 효소의 활성이 어느정도 감소된다. R-D-Ala-D-Ala를 첨가하고 다시 배양을 하게되면 잔존하는 효소의 활력에 따라서 D-Ala의 방출양이 달라지게 된다.

방출된 D-Ala는 D-amino acid oxidase에 의하여 피루빈산으로 산화되면서 동시에 과산화 수소를 생산한다. 과산화 수소는 환원색소(redox indicator)를 산화시키는 역할을 하며 산화된 indicator의 색은 핑크빛 오렌지색으로 변화된다.

만일 우유시료중 베타-락탐계 항균물질이 잔류되어 있지 않은 경우에는 예비배양중 효소의 활성이 활발하여 D-Ala의 생성량이 많아서 2번째의 배양에 들어갈 때 이미 색상이 핑크 및 오렌지색을 띄게 된다.

 

[준비물]

 

검사킷트 Penzyme

항온배양기 65℃

항온수조 2 (37℃, 82℃)

캡 튜브 (18 x 180 mm)

Voltex mixer

Micropipette (100 ul, 1000 ul)

피펫 (1 ml, 19 ml)

 

[검사방법]

Penzyme킷트의 사용방법

1) 50ul의 우유시료에 10ul의 효소 (vial No.1) 를 첨가하고 잘 흔들고 47C에서 5분간 배양시킨다.

2) Tweezer로 정제(vial No. 2) 를 반응물에 첨가하고 시험관을 가볍게 쳐서 중앙에 오 도록 한다. 그후 47C 에서 배양한다.

3) 배양 8분 후에 첫 번 결과를 본다. (첨부된 표준색조표 참조) 만일, 엷은 주황색 내 지 핑크빛 (표준 색상표의 2번째 박스) 일 경우 음성으로 간주한다. 만일, 노란색 (표 준 색상표의 3번째 박스) 일 경우, 2번째 배양까지 판정을 연장한다 (항균물질 함유 증거).

4) 다시 7분간 배양하고 시료를 꺼내어 색상을 관찰한다.

 

Penzyme 검사결과의 판정

핑크 및 오렌지색이면 음성 (penicillin G 0.005 IU 이하/ml).

2번째 박스의 색상이면 경고 ( 0.008 IU/ml),

노랑색이면 양성 ( 0.017 IU/ml)

 

 

면역화학적 방법

 

항균물질과 경쟁적으로 항체와 결합하는 항원에 표식하는 물질의 종류에 따라 효소면역학적 방법(EIA), 방사능 면역측정법(RIA) 및 화학 발광체 면역측정법(CIA) 등이 있다[표 3]. 이 방법들은 검체 시료중 잔류물질(항원)과 특이항체 사이에서 결합반응이 일어나는 면역학적 성질을 이용하여 표준항원물질에 표식되어있는 효소, 동위원소 또는 화학발광체가 발색되는 정도나 방사능의 양을 측정하여 정성 및 정량에 이용한다. 면역화학적 방법은 검출감도가 높고, 재현성이 높으며, 특이성이 우수할 뿐만 아니라 손쉽게 이용이 가능하도록 킷트화 되어 있어 현재 널리 사용되고 있다.

 

표 3 면역화학적 원리를 이용한 항균물질 검사킷트의 종류

검사방법           원리                검출 항균물질     검사조건        검사비용           대상시료

Penzyme법     효소면역법        베타-락탐계        47℃/15분      2,000원/점        우유

CharmII법        수용체정량법    모든 항균물질      85℃/3분        6,000원/점        우유,식육,사료, 계란,혈청,뇨

Lactek              면역항체법      대부분                  상온/4분       1,500원/점        우유,유제품

Agri-Screen     면역항체법      설파메타진                                                        우유

 

기타 면역항체법으로 Cite Probe법, Signal법, Ez Screen법 및 Spot test 등 있다.

 

기기분석법

 

위의 방법들이 우유중 잔류물을 신속하게 수종의 시료를 검출할 수 있으나 최대허용잔류수준이 설정되어 있는 항균물질에 대하여 정량분석을 수행하려면 액체 크로마토그라피(HPLC; High- performance liquid chromatography)나, 가스 크로마토그라피(GC: Gas chromatography)를 사용하여 정밀분석을 하여야 한다. 기기분석에 의한 잔류항균물질의 확인정량은 시료처리방법의 어려움으로 인해 정량법의 개발이 제한적이었으나, 신속 처리법의 개발로 인해 단시간에 대량의 시료를 처리할 수 있는 수준에 이르렀다.




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