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미생물이야기 분화된 근육 세포를 다시 자랄 수 있게 만들어 주는 화합물을 찾는 검색계를 이용해myoseverin이라는 화합물을 발견
2013-08-14 16:03:55
이엠생명과학연구원

정방향 접근법에서는 관측하려는 생물학적 현상을 먼저 정의하고, 다수의 분자를 투여해서 원하는 변화를 유발하는 분자를 골라낸다. 선택된 분자는 변화 유도에 중요한 역할을 담당하는 단백질에 결합하여 그 기능을 억제하거나 활성화시킨 것으로 생각할 수 있고, 다음 단계로 분자가 결합하는 단백질의 규명과 작용기작을 연구할 수 있다. 정방향 접근법에 의한 실제적인 연구의 예로 myoseverin의 발견과 개발을 기술해 본다.


1. 화합물 확보: 우선, 원하는 현상을 유도할 기회를 높이는데 필요한 수의 화합물을 확보하기 위하여, 조합화학 (Combinatorial Chemistry)적 합성 방법으로 퓨린라이브러리를 구축하였다. 다수의 화합물은 방사선 조사에서 무작위로 얻어지는 다수의 돌연변이 유발에 비유될 수 있다. 

 

 

2. 관찰하고자 하는 현상 정의: 분화가 끝난 신경세포나 근육세포들은 증식 시키기가 어렵다. 따라서, 상처를 입게되면, 세포가 제대로 자라지 않아서 상처부위를 아물게하고 재생시키는 것이 어렵다고 알려져 있다. 이 연구에서는 분화된 근육세포를, 다시 자라 수 있는 형태로 바꾸어 주는 현상을 유도하는 화합물을 찾는 것이 일차 목적이었다. 분화된 근육조직은 근육세포들이 서로 연결된 튜브구조를 이루고 있다. 수백개의 퓨린 화합물을 96구멍판에 키운 근육조직에 각각 투여하여 연결된 근육세포들을 떼놓는 화합물을 찾아내었다. 이 화합물은 근육튜브(myotube)를 자르는 (severing) 퓨린 (purine)이라고 하여, myoseverin이라고 명명되었다. 실제로myoseverin은 근육튜브를 잘라서 세포들을 하나씩 떼놓았을 뿐만 아니라, 화합물을 씻어내고 분열에 필요한 양분을 가해주면 세포숫자를 늘리면서 증식하였다. 더욱 희망적인 사실은 증식된 세포들이 분화 조건에 들어가면, 다시 근육튜브를 만든다는 점이다. 즉, 이 화합물을 근육이 손상된 조직에 주사하면, 일부 근육세포가 다시 자랄 수 있는 형태로 바뀌어서 증식하고 손상된 근육을 대신할 새로운 근육조직을 만들 수 있을 것으로 기대된다.


 

                                               화합물로 처리하기전의 근육세포  


                                              myoseverin으로 처리한 후의 근육세포

 

3. 화합물이 결합하는 목표 단백질의 규명: 원하는 현상을 유도하는 화합물을 찾아내는 것이 연구의 가장 중요한 전초단계이기는 하지만, 화합물이 결합하는 목표 단백질을 규명하고 그 작용 기작을 알아내는 것이 사실은 더 어려운 작업이다. 활성을 가진 화합물이 존재하는지 아닌지는 관찰하는 현상만 잘 정의되어 있으면, 가부간의 결과를 비교적 짧은 시간 안에 볼 수 있기 때문이다.


myoseverin의 경우에는 세포의 골격 구조가 급격하게 변한 점에 착안하여, 세포골격을 만드는 단백질이 공격받았을 것으로 예상하고, 형광표지된 항체를 이용하여 세포영상을 관찰하였다. 다음은 근육 세포의 골격을 이루는 중요한 부분인 미오신을 항체로 염색한 것이다. 녹색은 미오신이고, 파란색은 핵이다.

                                              화합물로 처리하기 전의 근육세포 

                                               myoseverin으로 처리된 근육세포

Myoseverin으로 처리되기 전에는 세포들이 나란히 연결되어 있는 것을 볼 수 있는데, Myoseverin으로 처리하고 나면 세포들이 하나씩 떨어져 나가는 것을 볼 수 있다. 그러나, 미오신이 목표단백질인지는 확실하지 않다. 몇 가지 골격 단백질들을 염색해 보았지만, 비슷한 영상만을 얻었는데, 마이크로튜브를 만드는 튜불린을 염색했을 때 재미있는 결과를 얻었다. 역시 녹색은 튜불린이고, 파란색은 핵이다.


        화합물로 처리하기 전의 근육세포   

    

                                                myoseverin으로 처리된 근육세포

myoseverin으로 처리하기 전에는 이전 사진과 비슷하게, 마이크로튜브가 세포들을 연결하면서 평행하게 달리고 있는 것을 보여주는데, myoseverin로 처리된 세포에서는 마이크로튜브가 깨져나가는 모습을 보여준다. 따라서, myoseverin이 튜불린 혹은 마이크로튜브를 직접 혹은 간접적으로 공격할 것으로 생각되었다. 마이크로튜브는 a, b-튜불린이합체를 단위체로 이용하여 만든 튜브형태의 구조물로서 세포의 형태 유지와 세포분열시 염색체의 이동에 관여한다.

                                                    튜불린 -- 마이크로튜브 그림

 

 

튜불린은 GTP 결합자리를 가지고 있으면서, 마이크로튜브를 만드는 과정에서 가수분해를 통해 GTP를 GDP로 만드는 GTPase의 일종이다. 마이크로튜브는 자라나는 +말단과 짧아지는 ?말단을 가지고 있는데, 세포분열시에는 잘 통제된 마이크로튜브의 생성과 파괴가 정확한 염색체 이동 등에 필수적으로 요구된다. 마이크로튜브를 깨부수거나, 튜불린으로부터의 합성을 방해하는 천연물 (vinca alkaloids, cholchicine)들은 정상적인 세포분열을 방해한다. 콜치신은 우장춘 박사로 유명한 씨없는 수박을 만드는 데 사용된 약물이다. 한편, 만들어진 마이크로튜브를 지나치게 안정화시켜 역동적으로 변화하는 것을 방해하는 탁솔 (taxol) 역시 정상적인 세포분열을 막아서 유망한 항암제로 사용된고 있다. 마이크로튜브가 기능을 발휘하는 데에는 마이크로튜브 뿐만 아니라 그 주위에 붙어있는 보조 단백질 (MAP: microtubule associate proteins)들의 역할도 중요하다. 따라서, myoseverin이 튜불린에 직접 작용하는 지, 주위의 다른 보조단백질에 작용하는 지 명확하지가 않다. 이를 확인하기 위해서 정제된 튜불린을 Cytoskeleton이라는 회사에서 구입하여, 적당한 용매 조건에 넣어주면 스스로 마이크로튜브를 만든다. 여기에myoseverin을 넣어주면, 튜브구조가 깨끗하게 사라진다. 즉, myoseverin은 튜뷸린 혹은 마이크로튜브에 직접 작용한다는 것을 알 수 있다.

  

이상의 결과에 의해, 시험관 속에서는 튜불린이myoseverin에 의해 공격받는 다는 것이 증명되었으나, 살아있는 세포 속에는 어떨까. 생물학적 활성을 가진 화합물이 결합하는 결합 단백질을 찾기위해 일반적으로 많이 쓰이는 방법은 덩치큰 고체상 수지를 이용해서 활성분자의 친화성칼럼 (affinity matrix)을 만들어, 목표 단백질을 낚시질 하는 것이다. 즉, myoseverin 분자의 한 부분에 이음이를 달아서, 고체상 수지에 붙여 낚시대를 만들고 세포질 혼합물에 일정 시간 푹 담궜다가, 걸러서 수지에 들러붙은 단백질을 분석하는 것이다. 그러나, myoseverin의 활성 (단백질 결합 능력)을 죽이지 않으면서 이음이를 다는 것이 쉬운 작업은 아니다. 이것은 화학생물학 접근법에서 마주치는 잘 알려진 문제점이다.

Myoseverin의 경우에는 이음이를 붙인 후 수지에 연결하지 않고, 스트렙타비딘이라는 단백질과 강력하게 결합하는 것으로 알려진 바이오틴 (biotin)과 화학적으로 친핵제에 강한 활성을 가진 작용기를 연결한 분자를 친화성분자로 이용하였다. 이 방법의 장점은 세포를 갈아서 처음부터 단백질 혼합물을 만들지 않고, 이 친화성 분자를 살아있는 세포에 먹여서 목표단백질과 결합하도록 유도할 수 있다. 목표 단백질이 이 분자에 결합하면 화학적 활성기가 단백질의 친핵체와 결합하여 공유결합을 만들게 되고, 바이오틴을 이용하여 스트렙타비딘 칼럼으로 목표단백질을 낚시질 할 수 있는 것이다. 실험결과 살아있는 세포속에서도 튜불린이 이 친화성분자에 선택적으로 결합한다는 것을 확인 할 수 있었다.

정리하면, 분화된 근육 세포를 다시 자랄 수 있게 만들어 주는 화합물을 찾는 검색계를 이용해myoseverin이라는 화합물을 발견하였고, 이러한 현상을 유도하는 목표단백질이 튜불린이라는 것을 증명하였다. 고전적인 유전학과 비교했을 때, 목표가 되는 유전자의 존재를 파악할 수 있을 뿐만 아니라, 목표단백질의 활성을 조절할 수 있는 작은분자 스위치까지 동시에 얻을 수 있는 장점이 있다. 이렇게 찾아진myoseverin은 유망한 신약후보물질로 활용될 수 있다.




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