커뮤니티 > 미생물이야기



미생물이야기 미생물 감염 진단의 다양한 방법에 대해 알아보자.
2013-08-16 16:18:24
이엠생명과학연구원

미생물 감염 진단

 

1. 감염증의 진단 과정

문진/진찰소견/감염증의 의심

 

염증반응 진단/백혈구수/CRP 반응

화상진단/X 선검사/X선 CT/MRI 진단

병원미생물의 검색/항생제 감수성검사/면역학적검사

 

진단

 

2. 검체의 채취

적절한 시기의 채취 : 발병초기

 

화학요법 치료 시작전에 채취

 

화학요법 치료중인 환자 : 치료 일시중단

 

무균조작으로 검체를 채취

 

무균적으로 멸균용기에 넣는다

 

적절한 환경에 보존 : 실온 , 부란기, 냉장보존

 

3. 검체의 수송, 보존

세균, 진균 등이 혼합된 검체 : 4℃ 냉장고보존

 

검체를 저온에 보관시 사멸되는균- 임균, 수막염균, 적리아메바

 

바이러스 의심 검체- 4℃ 냉장고 보존(2~3일)- 장기간 보존시 : 밀패용기에 넣어 -70℃이하 동결보존

 

혐기성균 검체 보존시 : 혐기성용 전용 용기

일차 배양 배지

종류Tryptic soy agar와 혈액한천배지MacConkey 한천배지Eosin methylene blue (EMB) 배지Chocolate 한천배지Thayer-Martin (TM) 또는 변형된 Thayer-Martin (MTM) 한천배지Campylobacter 혈액한천배지 (Campy agar)Hektoen enteric (HE) 배지Xylose-lysine desoxycholate (XLD) 배지Salmonella-Shigella (SS) 배지Columbia colistin-nalidixic acid (CNA) 배지

Tryptic soy agar와 혈액한천배지

 

Tryptic soy agar (상품명 Trypticase soy agar; BBL)는 미생물 배양과 분리 목적으로 사용하는 배지로서 혈액을 첨가하면 균종의 용혈성을 알 수 있다. 그러므로 혈액한천평판배지는 영양강화배지이면서 용혈성을 구분하는 감별배지이다. Streptococcus pyogenes의 용혈을 찾기 위해 이 배지를 사용할 때는 배지를 백금이 등으로 배지 바닥까지 여러 번 천자한 후 배양한다. 천자된 부위는 산소압이 낮아져 산소에 불안정한 hemolysin O의 용혈을 증가시킨다. S. pyogenes의 선별을 위해서 혐기성 배양을 시행할 수 있다.

 

(2) MacConkey 한천배지

MacConkey 한천평판배지에는 담즙산염 (bile salts)과 유당이 들어 있다. 그람양성세균은 담즙산염에 의하여 억제되며 유당을 발효하는 세균은 분홍빛의 집락을 보이므로 이 배지는 그람음성간균의 선택배지이면서 유당발효세균을 확인하는 감별배지의 기능을 한다. Proteus spp.의 유주현상을 억제하기 위해서는 한천의 농도를 5%정도로 높이거나 NaCl을 빼고 배지를 제조한다. Hemorrhagic Escherichia coli (혈청형 O157:H7)는sorbitol 음성이므로 lactose 대신 sorbitol이 첨가된 MacConkey 배지를 사용하여 선별검사에 이용할 수 있다.

 

(3) Eosin methylene blue (EMB) 배지

이 배지에는 그람양성세균을 억제하는 eosin Y와 methylene blue를 첨가하여 그람음성 장내세균의 선택배지임과 동시에 유당 또는 자당 발효 세균을 구분할 수 있는 감별배지로 쓰인다. 유당 또는 자당을 발효하는 세균은 배지의 pH를 낮춰 진한 자줏빛에서 청색이거나 집락 중앙은 검고 가장자리는 무색을 보이며 비발효 세균은 투명하거나 무색의 집락을 보인다. E. coli 집락은 반사광으로 관찰하면 녹색의 금속성 광택이 관찰된다. 일부 포도상구균과 장구균은 작은 집락을 형성할 수 있고 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)집락은 가장자리는 사상형이며 배꼽 모양으로 대개 보라색이다. Proteus 균주의 유주현상은 한천의 농도를 5%로 올리면 막을 수 있다.

 

Chocolate 한천배지

 

Chocolate 한천배지는 기초배지 [Proteose No. 3 agar (Difco), Eugon agar (BBL), GC agar base (BBL, Difco, Gibco), Mueller-Hinton agar]에 혈액이나 헤모글로빈 또는 헴 (heme) 등을 첨가한 증균배지로서 배지 색이 갈색 또는 초콜릿색이 될 때까지 가열하여 만든다. 이 배지는 Haemophilus influenzae와 같이 일반배지에서는 배양이 어려운 세균의 분리에 사용되고 CO2 배양조건에서는 Neisseria meningitidis N. gonorrhoeae의 균성장이 잘되며 IsoVitaleX (BBL)나 Supplement B와 같은 성장촉진제를 넣지 않으면 Haemophilus가 증식되지 않는다. 이 배지는 한천의 농도가 낮아서 높은 습도가 필요한 균종의 증식에 도움이 된다. 젨혈액으로 만들 때는 멸균한 기초배지에 증류수나 탈이온수를 넣어 890 mL로 만든 후 잘 섞은 다음 끓을 때까지 가열한다. 121℃에서 15분간 멸균한다. 45-50℃로 식힌 후 무균적으로 100 mL의 탈지 면양혈액을 첨가한 다음 85℃에서 잘 저으면서 5-10분간 가열하여 초콜릿 색깔이 나게 한다. 50℃로 다시 식힌 후멸균한 Supplement B 용액을 넣고 잘 섞은 다음 페트리 접시나 멸균 관에 분주한다. 배지의 최종 pH는 25℃에서 7.3±0.2이다. 헤모글로빈으로 만들 때는 기초배지 (Difco)에 증류수나 탈이온수를 넣어 990 mL를 만든 후 잘 섞은 다음 끓을 때까지 서서히 가열한다. 121℃에서 15분간 멸균한다. 45-50℃로 식힌 후 멸균한 100 mL 헤모글로빈 용액을 첨가한 다음 85℃에서 잘 저으면서 5-10분간 가열한다. 50℃로 다시 식힌 후 Supplement B 용액을 넣는다. 배지의 최종 pH는 25℃에서 7.0±0.2이다. 헤모글로빈 100 mL 용액은 헤모글로빈 10 g에 증류수나 탈이온수를 넣어 만든 후 여과 멸균한다. 이외에도 GC 기초배지에 헤모글로빈과 Supplement A, B, VX 용액 (Difco) 중 하나를 첨가한 배지, 헤모글로빈이 포함된 GC II 배지에 IsoVitaleX (BBL)를 첨가한 배지 등이 흔히 사용된다. 각 배지의 성분과 제조 방법은 회사마다 약간씩 다르므로 배지 제조회사의 사용설명서에 따라 만들어야 한다.

 

Thayer-Martin (TM) 또는 변형된 Thayer-Martin (MTM) 한천배지

이 배지는 chocolate 한천배지를 변형한 것으로서 배지 내에 colistin, nystatin, vancomycin, trimethoprim의 4가지 항균제 (CNVT 억제제) 또는 trimethoprim이 없는 VCN 억제제(BBL)를 첨가하여 만들며 항균제의 농도는 같다. Colistin은 Proteus 균종을 제외한 그람음성세균, Nystatin은 효모세포, vancomycin은 그람양성세균, trimethoprim은 Proteus 균종의 증식을 각각 억제하기 때문에 상재균이 혼합되어 있는 검체에서 임균과 수막구균을 분리할 때 사용한다. Neisseria lactamica는 증식이 가능하다. Thayer-Martin 배지 제조방법은 매우 다양하다. 변형된 Thayer-Martin 배지는 GC medium base, dextrose, 한천을 500 mL의 증류수에 넣고 가열하여 녹인다. 별도로 2% 헤모글로빈 용액을 만든다. 두 가지 용액을 각각 121℃에서 15분간 멸균한 다음 55℃로 식힌 뒤에 배지와 헤모글로빈 용액을 잘 섞는다. 여기에 10 mL VCNT 항균제 용액과 Supplement VX 또는 IsoVitaleX 10 mL를 첨가하여 섞은 다음 20 mL씩 페트리접시에 부어 평판을 만든다.

 

 

Campylobacter 혈액한천배지 (Campy agar)

이 배지는 영양강화배지로서 Campylobacter jejuni의 선택배지로 사용한다. 직장면봉과 변을 배지에 직접 접종한다. Campy-thioglycolate 배지는 C. jejuni의 분리용 면봉 검체를 수송하거나 배지에 직접 접종하기 어려울 경우에 사용하며 하룻밤 냉장시킨 후 접종할 수 있다. 두 가지 방법을 모두 사용하면 C. jejuni의 분리율이 증가될 수 있다. 그러나 증균배지의 사용은 권장되지 않는다.

Campy 혈액한천배지는 기초배지에 증류수나 탈이온수를 넣어 890 mL를 만든 후 잘 섞은 다음 끓을 때까지 가열한다. 121℃에서 15분간 멸균한다. 45-50℃로 식힌 후 무균적으로 100 mL의 탈지 면양혈액을 첨가한 다음 항균제 용액을 넣고 잘 섞는다. 항균제 용액은 10 mL 증류수에 각각의 항균제를 넣은 후 여과 멸균한다. Campy THIO 배지는 제조 후 멸균 나사마개관에 3 mL씩 분주한다. 3 cm 면봉을 사용할 때는 5 mL씩 분주한다. Blaser 배지와 Skirrow 배지는 항균제의 성분만 차이가 있을 뿐 그 외의 성분은 같으며 Blaser-Wang 배지와 Butzler 배지의 기초배지는 Brucella agar base로 같지만 첨가하는 혈액과 항균제 종류가 다르다. Blaser-Wang 배지는 Columbia agar base를 이용할 수도 있다. 또한 혈액대신에 charcoal을 첨가하고 cefoperazone 항균제를 첨가한 Campylobacter charcoal differential agar와 Campylobacter blood-free selective agar도 있다. Preston 배지의 항균제 용액은 acetone과 증류수를 50:50 비율로 혼합한 10 mL에 항균제를 첨가한 후 여과 멸균하여 만든다.

 

Hektoen enteric (HE) 배지

이 배지는 분변 검체에서 Salmonella Shigella 균주를 분리하는데 사용하는 중등도 선택배지로서 lactose, sucrose, salicin을 첨가되어 있기 때문에 이들 당을 발효하지 않는 Salmonella Shigella 균주는 청색 또는 녹색 집락을 형성하며 당발효 균종은 배지 내의 pH를 낮춰 bromothymol blue 지시제를 노란 색을 띠게 하고 acid fuchsin은 적색을 띠게 되어 결국 이 두 가지 색이 결합되어 귤색 또는 분홍색이 된다. 대부분의 장내세균은 3가지 당 중 하나 이상을 발효한다. Salmonella 균주는 녹색에서 청록색을 띠며 보통 집락 중앙은 검은 색이며 Shigella 균주는 보통 녹색이다. 그러나 당발효 장내세균에 의해 Salmonella Shigella 균주가 둘러 쌓여 있을 때는 녹색이 감도는 옅은 분홍색을 띠며 담즙이 침전된 주위에 있는 집락은 대개 투명한 훈륜이 있다. Citrobacter 균주는 대개 억제되지만 작고 청록색의 집락으로 증식될 수 있으며 Proteus 균주 또한 대개 억제되나 증식된다면 H2S 생성균주는 중앙이 검으면서 노란 색 또는 녹색의 집락을 보이며 H2S를 생성하지 않는 균주는 Shigella 균주와 유사하지만 크기가 Shigella보다 작다. E. coli, Klebsiella Enterobacter 균주 등은 연한 귤색 또는 붉은 분홍색이며 집락 주변에 분홍색 침전물이 흔히 관찰된다. 이 배지에는 Salmonella-Shigella 배지보다 담즙 양이 많지만 peptone 양이 많아 생성된 산을 완충 작용하며 지시제 또한 Salmonella Shigella에 대산 독성이 적기 때문에 병원성 균종에 대한 억제 작용이 약하다.

 

Xylose-lysine desoxycholate (XLD) 배지

이 배지는 분변 검체에서 설사 원인균, 특히 Shigella를 분리하는데 사용하는 선택감별배지로서 배지내의 sodium desoxycholate는 장내 상재균의 일부를 억제한다. 또한 배지내에는 xylose, sucrose, lactose가 첨가되어 있기 때문에 이들 당을 발효하지 않는 Shigella, Providencia와 일부 Proteus 균주는 적색 집락을 형성하며 당발효 균종은 배지 내의 pH를 낮춰 phenol red 지시제가 노란 색이 된다. Salmonella Edwardsiella 균주는 xylose만 발효하며 lysine의 카르복실기를 분해한다. 그러므로 배지 내의 xylose-lysine 비율은 Salmonella Edwardsiella 균종이 xylose를 먼저 발효하여 xylose가 고갈되면 lysine을 분해하여 적색 집락이 되도록 맞춘다. 또한 lysine decarboxylase 양성인 장내 균종에 의한 배지의 알칼리화를 막기 위해 lactose와 sucrose를 2배 증량하여 과량의 산생성이 되도록 첨가한다. Ferric ammonium citrate 지시제는 hydrogen sulfide와 반응하므로 H2S생성 균주는 검은 색이 된다. Escherichia spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Citrobacter diversus, Providencia rettgeri, Morganella morganii, Yersinia enterocolitica 등의 균종은 노란 색 집락이며 Citrobacter frundii, Proteus vulgaris, P. mirabilis 등의 균종은 중앙이 검은 노란 색 집락이고, Shigella, Providentia, H2S-negative Salmonella, Pseudomonas, 일부 P. rettgeri 균종은 적색 집락이며 Salmonella Edwardsiella 균주는 중앙이 검은 적색 집락이다. 제조한 XLD 배지는 적색 빛을 띠고 투명해야 한다. 배지를 너무 과열하여 침전물이 생기면 집락이 다소 작아지는 경향이 있다. 노란 색 집락은 sodium desoxycholate의 침전 때문에 불투명하게 보인다. 배지내의 반응은 24시간이 지나면 노란 색이 적색으로 전환될 수 있으므로 배양 18-24 시간 내에 판독해야 한다.

제조 방법은 증류수나 탈이온수 1 리터에 배지를 넣고 잘 섞은 다음 과열하지 않고 서서히 끓인다. 121℃에서 15분간 멸균한다. 배지가 식는 중에 침전이 생길 수 있으므로 가능한 한 신속히 평판배지에 분주한다.

 

Salmonella-Shigella (SS) 배지

이 배지는 병원성 장내세균, 특히 Salmonella 균주를 분리하는데 사용하는 선택감별배지로서 Shigella의 일차적인 분리 목적으로는 권장되지 않는다. 배지 내의 bile salt와 brilliant green은 억제제로 작용하며 기질과 지시제로 유당과 neutral red가 들어 있으며 H2S 생성을 확인할 수 있는 지시제로는 sodium thiosulfate와 ferric citrate가 첨가되어 있다. 유당을 발효하는 E. coli, K. pneumoniae 등은 작은 분홍색 또는 적색 집락이고 유당을 발효하지 않는 Salmonella, Proteus, Shigella 균주 등은 무색 집락이며 H2S 생성 Salmonella 균주는 중앙이 검은 무색 집락을 보인다.

배지 60 g을 1 리터의 증류수에 넣고 잘 섞은 후 잘 저으면서 2-3분간 과열하지 않고 완전히 녹인다. 가압 멸균하면 안된다.

45-50℃로 식힌 뒤에 20 mL 씩 페트리 접시에 분주한다.

 

Columbia colistin-nalidixic acid (CNA) 배지

이 배지는 영양강화배지로서 그람양성구균의 선택배지로 사용한다. 배지 내의 colistin과 nalidixic acid는 각각 대부분의 그람음성간균과 Proteus 균주의 성장을 억제하며 혐기성 배양 조건에서는 Clostridium 균주는 억제되나 Bacterioides 균주는 증식된다. CNA 평판배지는 혈액 성분이 첨가되어 용혈성을 관찰할 수 있는 장점이 있다. Proteus 등의 그람음성간균이 섞여 있는 검체에서 그람양성구균, 특히 Streptococcus를 분리하기에 유용하다. Staphylococcus 균주 중에는 이 배지에서 억제되는 것이 있다. 사용 목적에 따라 배지 성분, 항균제 농도 등을 달리할 수 있으며 여러 가지 변형된 배지가 상품화되어 있다.

배지를 증류수에 넣고 잘 섞은 후 끓을 때가지 가열한 다음 121℃에서 15분간 가압 멸균한 뒤 45-50℃로 식힌다. 950 mL의 배지에 면양혈액 50 mL를 넣고 평판을 만든다. 감별배지에 흔히 사용하는 지시제는 표 6-5에 표시하였다.

 

 

4. 검체와 배양 배지

 

1) 소화기 검체 : 분변, 설사변, 직장면봉

SS, MacC, HE, XLD

 

2) 호흡기 검체 : 객담, 인두, 후두, 비강, 기관지 세척액

BAP, Cho. MacC.

3) 화농,수액 검체 : Thioglycollate broth, BAP, Cho,

4) 비뇨기 검체 : Thioglycollate broth, BAP, TM

 

5) 혐기성 세균 배양기기

 

Anaerobic jar gas pak 방법

Anaerobic chamber

Mixture gas

N2 80%, H2 10%, CO2 10%

혐기성 지시약 (anaerobic indicator)

Methylene blue : 호기적 조건 - 청색

혐기적 조건 - 무색으로 환원

6) 혈액 검체 배지

 

(1) 고전적인 혈액 배양배지

 

a. Thioglycollate broth

 

b. Trypticase soy broth

 

c. Brain Heart Infusion broth

 

(2) 자동화 혈액배양기

 

a. VITAL 자동화 혈액 배양기

b. Bactec 9240 Blood culture system

c. BacT/ Albert blood culture system

d. BacT/ALERT 3D 자동화 혈액 배양기

혈액/체액/결핵균 배양 동시가능

e. 혈액내 항산균 자동화 배양 장비




대전광역시 유성구 문지동 KAIST문지캠퍼스강의동L605호 대표이사:(원장)서범구 사업자번호:314-86-01479
전화번호:1800-0250 팩스번호:07074559748 관리자이메일:puom9@naver.com
이엠생명과학연구원. All Rights Reserved