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미생물이야기 미생물 분리시 일반적인 고려사항 유용 방선균의 분리 및 탐색 이엠생명과학연구원 서범구
2013-08-16 16:21:21
이엠생명과학연구원

토양 중에는 많은 종류의 미생물이 서식하고 있어 균주의 寶庫라 일컬어진다.

 

그래서 미생물을 분리하기 위해서는 주로 토양을 많이 이용하고 있다.

 

지금까지 이용되지 못한 새로운 토양 시료를 이용한다면 새로운 균주를 분리할 확률이 높아지고, 이로부터 산업적으로 유용한 신소재가 탐색될 가능성이 더 높아진다.

 

국가적으로 보면 분리된 미생물뿐만 아니라 미생물의 주요 서식 장소인 토양 시료도 중요한 자원이라 할 수 있다. 앞으로 국내외 토양 자원의 보존 및 활용에도 더욱 적극적이며 체계적으로 대처해 나가야 할 것이다.


최근의 연구 결과에 의하면 토양에 賦存하는 미생물의 3-5%만이 분리되고 있다고 한다.

이것은 적절한 토양 시료를 수집하여 미생물을 분리 활용한다면 앞으로 더 많은 신물질이 미생물로부터 탐색될 수 있음을 시사한다. 그래서 선진국에서는 모든 가능한 방법을 동원하여 세계 각지의 토양 시료를 수집하고 있으며 개발도상국에서도 UR 또는 생물학적 다양성 협약 등을 통하여 자국의 생물 자원을 보호하는 등 세계적인 자원 전쟁에 대비하고 있다.


방선균은 주로 토양 중에 서식하며 비옥한 토양에는 106 cells/g soil 정도의 밀도로 존재한다.

일반적으로 방선균은 포자 상태에서 휴면하다가 영양과 습도가 적당하거나 다른 미생물의 영향을 받아 생리화학적으로 균 생육에 적합한 환경이 되면 포자가 발아하기 시작하고 균사가 생장한다.

 

보통 하나의 토양 시료로부터 10 여종의 상이한 방선균 균주를 분리해 낼 수 있다. 동일 지점이나 토양 환경이 비슷한 지점에서는 동일한 미생물이 서식하고 있고, 또한 같은 종류의 미생물은 생리?생화학적인 특성이 비슷하여 생산되는 생리활성물질도 중복적일 가능성이 높을 것이다. 따라서 신물질탐색 효율성을 높이기 위해서는 중복되지 않는 많은 수의 방선균을 분리하여 이용하여야 한다. 그래서 일차적으로는 토양 시료 채취 장소를 선택할 때 토양 환경이 다른 곳을 선정하는 것이 중요하다.

현재 국내에서는 미생물탐색 관련 연구를 효과적으로 수행하기 위하여 생명공학연구소를 중심으로 체계적인 미생물 분리 연구가 이루어지고 있으며 분리된 미생물은 산학연에서 공동으로 활용하도록 G7 <선도기술개발사업>을 통하여 지원하고 있고 인터넷 상에서 서비스가 가능하며 홈페이지 주소는 http://platform.kribb.re.kr 이다.

 

분리된 미생물을 장기 보존하는 균주 은행 기능도 가지고 있어 연구자들이 필요한 때에 원하는 균주를 분양 받아 사용할 수 있으며, 국내 미생물 자원을 체계적으로 보존하기 위한 노력을 지속적으로 경주하고 있다. 앞으로 국내외의 토양 자원을 더욱 효과적으로 이용하게 된다면 신약 등 생물 소재 산업에 크게 기여하게 되고 나아가 국가 경쟁력을 제고시키게 될 것이다.


시료 채취법
방선균은 포자가 비, 바람 등에 의하여 한 지점에서 다른 지점으로 잘 이동하기 때문에 시료를 채취하는 장소간에는 수평적으로는 5-20 km 이상 떨어진 지점이 좋다. 과거에는 미경작지 토양을 중심으로 지하 2-5㎝ 지점에서 채취하는 것을 권장하기도 하였다. 그렇지만 본 저자들의 연구 결과에 의하면 같은 지역이나 가까운 거리라 하더라도 논, 밭, 산림, 초지, 강가, 습지, 사막, 해안, 호수 침적토, 화산 지역 등 토양 환경이 서로 다른 곳에는 상이한 종류의 방선균이 서식하므로 별도의 시료를 채취하는 것이 좋다. 특히 수직적으로는 깊이에 따라 서식하는 미생물의 변화가 크므로 동일 지점에서도 지표층, 지하 10cm, 지하 50 cm 등 여러 깊이별로 나누어 별도로 시료를 채취하는 것이 효과적이며 이 때에는 채취한 장소의 깊이를 기록해 둔다. 그러나 일반적으로 지하 1m 이하에서는 서식하는 방선균이 적게 분포한다.
특정한 나무숲에서는 나무 뿌리 부근의 근권 토양을 잔뿌리와 함께 채취하는 것이 좋다. 왜냐하면 근권 토양에서는 아주 인접한 곳이라 하더라도 미생물과 식물간의 특이한 상호작용으로 인하여 서식하는 방선균의 종류가 상이하기 때문이다. 그리고 시료 채취 시는 가능한 한 나무 이름을 함께 기록하여야 한다.
많은 양을 채취하기가 어려운 특별한 지역의 경우는 한 시약 스푼 정도의 양으로도 균분리가 가능하지만 균주의 재분리 또는 다른 용도로 사용될 경우가 있으므로 시료의 적정 채취량으로서는 대체로 100 그램 정도가 적당하다. 부피로 보면 종이 커피잔 1/2 정도의 분량이 된다.
그리고 채취된 시료는 검정 네임펜을 사용하여 <예시>와 같이 비닐 봉투에 날자, 지명, 토양 환경 등을 기록한다. 특히 채취한 곳의 환경이나 조건 등은 자세히 기록한다. 기록한 것이 지워지지 않도록 주의하며 별도의 노트에도 일련번호와 함께 채취 환경과 관련한 사항을 기록해 두는 것이 좋다.
채취 방법으로서는 긴 시약 스푼 등 채취 기구를 이용하여 토양 50 ~ 100 g을 채취하여 비닐 봉지에 담는다. 운반 용구로는 일반 폴리비닐 봉지가 가장 적당하다. 한 번 채취한 후 다음 시료를 채취하기 전에 시료간의 오염을 방지하기 위하여 티슈나 물을 사용하여 시약스푼을 깨끗이 세척한다. 채취 대상으로는 토양 시료를 주 대상으로 하지만 토양 시료외에 낙엽, 퇴비, 사료, 부엽토, 분비물 등 동?식물 재료와 호수 침전물 등 퇴적물도 좋은 균 분리원이 될 수 있다.
채집된 시료의 효율적인 보존을 위해서는 채취한 후에는 가능한 한 냉장 보존하고, 냉장 보존이 어려울 때는 시료의 온도가 높아지거나 너무 낮아 얼지 않도록 주의하여야 한다. 특히 차량을 이용하여 시료 채집을 하거나 자동차 내에서 시료를 장시간 보관할 때에는 차내의 온도가 너무 높아지지 않도록 주의를 요한다.
기타 주의 사항으로서는 시료간에 서로 섞이거나 주위로부터 오염이 되지 않도록 한다. 채집된 시료는 가능한 한 짧은 시간 내에 실험실로 가져와서 균 분리하여야 한다. 경험적으로 볼 때, 시료 보존 시간이 길어질수록 균 분리 효율성은 떨어진다.

 

시료를 채취한 후에는 채취 후 즉시 미생물을 분리하는 것이 가장 좋다. 그러나 실제로는 그렇게 하기 어려운 경우가 많고 한 번이 아니고 수 차에 걸쳐 균분리 하는 경우에도 시료를 보존해 가면서 균분리 하게 된다. 이 때에는 실험실까지 시료를 적절하게 운반해야 하며 물이나 토양 시료의 경우에는 일반적으로 냉장 보존(4℃)을 실시한다. 버섯이나 사상균 종류는 종이 봉투에 넣어 보존하는 것이 좋다. 비닐 봉투 등 밀폐된 용기를 사용하면 습도가 높아지거나, 고온 또는 혐기적 조건으로 변하여 微生物相이 변 할 수 있으므로 주의하여야 한다. 사상균류의 경우에는 풍건한 후 실온에 보존하는 경우도 있다.
수분 활성이 높거나 영양분이 많이 함유되어 있거나 여러 가지 이유로 냉장 보존 중에도 微生物相이 변하기 쉬운 경우에는 냉동 보존하는 방법이 좋다. 이 때에 주의할 사항으로는 ①시료 중에는 가능한 한 NaCl 등의 전해질이 많이 첨가되지 않도록 NaCl이 많이 함유된 시료는 -25℃ 이하에서 보존한다.(NaCl의 共融点이 -21.6℃ 이기 때문) ②Glycerin, DMSO, sucrose, skim milk 등을 보호제로 첨가하면 좋다. ③보호제의 첨가가 좋지 않은 경우도 있으므로 주의를 요한다. ④장기간 보존하기 위해서는 -50℃ ~ -85℃ 또는 그 이하가 좋다.
일반적으로 미생물 분리용 시료를 냉동 보존하기 위해서는 단기적으로는 -20℃ ~ -30℃, 장기적으로는 -50℃ ~ -85℃ 또는 액체질소를 이용한다.


미생물 분리

미생물을 자연계로부터 분리하는 것은, 미생물과 서식지와의 상호관계, 미생물과 식물의 상호관계 등 미생물 생태학적인 관점에서 관심을 가지는 경우와 특정한 미생물 種 또는 미생물 群을 목적으로 하는 경우가 있다. 전자의 경우에는 가능한 한 많은 미생물을 분리해야 하므로 비선택적 분리 배지를 사용하고 배양 온도나 pH에 있어서도 넓은 범위에서 미생물이 생육 가능하도록 유도하여야 한다. 후자의 경우에는 특정한 배양 환경이나 조건을 설정함으로써 목적으로 하는 미생물만이 생육케 하여 분리하게 된다. 이와 같이 목적에 따라 미생물을 분리하는 방법이 다르게 되는데 앞에서 언급한 균분리원의 선정에 있어서도 달라져야 할 것이다. 여기에서는 방선균을 예로서 자세히 설명하고자 하며, 기타 미생물 群에 대해서는 일반적인 방법을 간단히 알아본다.

 

미생물의 분리 목적
미생물을 분리하는 목적에 따라서 실험 방법이 달라지게 되는데, 자연계로부터 미생물을 분리하는 목적은 다음과 같이 나눌 수 있다.
i) 자연계에 존재하는 미생물相의 이해
- 대상 환경에 賦存하는 전체 미생물의 質的, 量的인 해석
- 대상 환경에 賦存하는 특정 종류나 특정 활성을 나타내는 미생물의 質的, 量的인 해석
ii) 특정 미생물의 분리
- 分類學的으로 특정한 미생물 種이나 群의 분리
- 특정한 생리?생화학적인 활성을 지닌 미생물의 분리


미생물 분리시 일반적인 고려사항
어떤 환경 하에 서식, 활동 중인 미생물의 종류, 수, 생리활성 등을 정확히 파악하는 것은 미생물과 환경과의 상호관계, 미생물간의 상호관계를 이해하는데 중요하다. 그러나 미생물의 수가 아주 많기 때문에 특수한 환경으로 국한하지 않는 한 실제로는 정확히 파악한다는 것은 거의 불가능하다. 일반적으로는 곰팡이, 효모, 일반 세균, 방선균, microalgae 등에 적합한 분리용 배지를 적용하여 희석평판법으로 분리한다. 그렇지만 시료의 희석으로 인하여 minor하게 존재하는 미생물이 콜로니를 형성하여 분리되기는 어렵다. 그리고 어느 정도의 밀도로 존재하는 미생물도 생육이 느린 경우는 분리되기 어렵다. Dormant한 상태와 vegitative한 상태의 구별도 어렵다. 따라서 대상 시료 중의 전체 미생물을 분리하는 것은 어려우므로 결국은 특정 미생물 종류 또는 활성을 중심으로 파악하게 된다고 하겠다. 따라서 미생물을 분리하는 방법은 연구 목적과 연결하여 적용하여야 할 것이다.
위생학적 관점에서 어떤 시료 중의 특정 미생물의 수를 조사하거나 유무를 검출하는 경우도 있을 것이고, 생태학적인 측면에서 특정 미생물 또는 특정 생리?생화학적 활성을 지닌 미생물을 연구하고자 하는 경우도 있다. 그리고 이러한 환경 미생물학적인 관점과는 달리 미생물 조성을 숫적인 면에서 관찰하고자 할 때에는 분류학적인 관점에서 특정한 미생물 종을 분리하는 경우와 주로 응용, 개발 연구를 위하여 특정한 활성을 지닌 미생물을 분리하는 경우가 있다. 이 때는 어느 경우이건 미생물이 dormant한 상태인지 vegitative한 상태인지 알 필요가 없을 것이다. 다만 분리하는 방법을 어떻게 할 것인지가 관건이 된다. 숫적으로 minor하게 존재하는 경우도 마찬가지라 하겠다. 이 때는 미생물의 생태, life cycle, 생리?생화학적 활성, 균분리원의 성질 등을 종합적으로 이해한 후 분리 조건을 잘 설정하여야 한다. 지금까지 알고 있는 지식에 대해서 면밀히 검토하고 여러 가지 방법을 “try and error" 식으로 시도하는 경우가 많다.
목적으로 하는 특정한 활성과 성질 등이 선택적 분리 조건으로 이용될 수 없는 경우도 있다. 이러한 경우에는 미생물을 분리한 후에 그 활성을 스크리닝하여 활성이 강한 것을 선발해야 한다. 이 때에도 적절한 균분리원의 선정, 예상되는 微生物群의 선정, 목적으로 하는 미생물을 효율적으로 분리하는 방법과 정확, 신속하고 간편하게 스크리닝 할 수 있는 방법의 개발에 대한 선행 연구가 필수적이다.


자연계로부터 미생물을 분리하는 일반적인 방법은 다음과 같다.

 

생육 조건을 이용한 분리 방법

微生物相의 解析
Dominant한 미생물의 분리
분리 후 활성 스크리닝 

비선택적 분리(일반적분리)

평판 배양 - 생세포
- 단일 영양원(C, N)
- 단일 에너지원(S, Fe, He, Light)
- 산소
- 물리화학적 인자(온도, pH, 압력, Aw, 방사선)
- 항생물질, 약제, 중금속


▷ 선택적 분리
집적 배양
(batch식, 연속식)

 

생물학적 특성을 이용한 분리 방법

▷ 채집 버섯, 변형균, 병반 부위 등
▷ 운동성 이용 ?走化性
走光性
走磁性
▷ 성장 특징을 이용 균사의 신장(곰팡이, 방선균)
▷ 포자 전파 방법 胞子의 射出 또는 遊離(修生菌)
▷ 생활환, 遷移 등을 이용 저온 처리(dormancy)


자실체 형성 유무
溶菌班(Bedelovibrio)
濕室法
열, 알카리, 알콜 처리(胞子의 경우)


물리적 조작(기구)을 이용한 분리 방법
▷ 단세포(단포자) 분리법 ?Micromanipulation
▷ 농축법 ?Membrane filter, cotton, suction
▷ 분별원심법
▷ 분산법 시료분쇄
Detergent 사용

 

방선균 분리

토양시료로부터 방선균을 분리하는 일련의 과정을 그림 1에 나타내었다. 일반적으로 토양시료를 채취한 후 보존하는 한편, 1g 정도의 시료를 들어내어 전처리하거나 적당히 희석하고, 고체 배지상에 도말한 후, 배양기내에서 배양한다. 일정기간 후에 나타난 콜로니로부터 상이한 균주를 선별하고 순수분리 하여 균주를 보존하거나 액체배양한 후 각종 스크리닝에 사용하게 된다.
방선균을 효율적으로 분리하기 위해서는 방선균 이외의 다른 미생물의 생육을 억제시킬 필요가 있다. 이를 위해 방선균 포자가 지닌 열과 건조에 대한 내성, 약제내성, 유기물 자화성 등 특성을 이용한다. 방선균은 한천 고체 배지상에서 비교적 단단한 콜로니를 형성하며 배지중으로는 기질균사가 생장하고, 공중에 형성되는 기균사 부분은 건조한 분말과 같은 양상을 나타내므로 일반 세균과의 식별이 비교적 용이하다.

 

일반적으로 새로운 방선균을 분리하거나 중복되지 않는 방선균을 많이 분리하게 되면 신물질이 탐색될 가능성이 높아진다고 하겠다. 신 종 방선균을 이용하면 신물질의 탐색 효율성은 높아지겠지만 신 종 방선균을 분리하는 것 자체가 쉽지 않으며, 신 종 방선균을 분리하였다 하더라도 신물질이 반드시 탐색되는 것은 아닐 것이다.
따라서 먼저 다양한 종류의 방선균을 분리하고자 노력하면서 신종 방선균을 분리하려는 작업을 병행하는 것이 좋을 것으로 생각된다. 본 장에서는 신 종 방선균을 분리하는 방법보다는 하나의 토양시료로부터 다른 종류의 방선균을 최대한 많이 분리하는 방법을 중심으로 논하고자 한다. 즉, 자연계에 희소하게 존재하거나 분리가 어려웠던 방선균을 보다 더 체계적으로 분리하고자 하는 관점에서 살펴보고자 한다.

 

특정 속 희소방선균의 분리
새로운 항생물질 또는 생리활성물질을 스크리닝하기 위해서는 독창적이며 선택적인 스크리닝 방법을 개발하여야 하지만 대개의 경우 독창적인 새로운 스크리닝 방법 개발은 쉽지 않다. 따라서 이미 개발된 스크리닝 방법을 조금씩 변환하여 적용하는 경우가 많다. 목표 지향적 스크리닝(target directed specific screening)을 하거나 특이한 스크리닝 방법을 적용하기 어려운 경우에는 방선균 분리시, 희소방선균을 중심으로 균분리하되 중복되지 않는 다양한 균주를 분리하는 것이 바람직하다. 그리고 모든 균종을 대상으로 하여 탐색하기는 어려우므로 몇 가지 특정 속 방선균을 대상으로, 선택적으로 분리하여 이용하는 것도 좋은 방법이다.
그 예로써 일본 Meiji Seika사에서는 기균사를 형성치 않으며, 오렌지 또는 갈색을 띠며, colony의 형태가 가죽 표면처럼 단단한 것을 지표로하여 Dactylosporangium 속 방선균을 선택적으로 분리?탐색할 수 있었다. 그 결과 200여 점의 토양시료로부터 Dactylosporangium 속 방선균 40주를 분리할 수 있었으며 이들로부터 dactimicin, SF2185, SF2107, SF2139등의 신물질을 탐색하였다(3). 그리고 일본 Yamanouchi사에서는 Okinawa 섬에서 채집한 토양시료 145점으로부터 Saccharopolyspora 속 방선균 206주를 분리하였고 이로부터 hatomamicin을 비롯한 수 종의 신물질을 탐색하였다(4). 이외에도 Actinoplanes, Micromonospora, Microbispora, Dactylosporangium, Streptosporangium, Streptoverticillium 등 특정 속 방선균을 집중적으로 분리하여 이로부터 여러 가지 신물질을 탐색한 바 있다(5-8).
이와 같이 특정 속 방선균을 탐색 연구의 대상으로 하는 경우에는 지금까지 이용되지 않았던 방선균을 분리, 이용할 수 있게 될 뿐아니라 신 속과 신 종에 속하는 방선균을 분리할 확률이 자연히 높아지게 된다. 따라서 스크리닝에 이용한 균주에 비해 신물질이 탐색되는 비율은 증가될 것이다. 그러나 한편으로는 많은 수의 방선균을 분리하기 어렵다는 단점도 있다. 따라서 사용하는 스크리닝 방법의 특이성, 스크리닝의 속도와 경제성 등 여러 가지 측면을 고려하여 적절한 방법을 강구하여야 할 것이다.
한편 특정 속 희소방선균을 분리하는 방법에 대해서는 앞서 소개한 바와 같이 많은 연구가 진행되었다. 그리고 여러 가지 형태적이며 생리 화학적인 특징이 각 방선균 속별로 상이하다. 따라서 일률적으로 적용하여 소개하기는 어려우므로 특정 속 희소방선균을 분리하는 방법에 대해서는 인용한 참고문헌을 활용하기 바라며 여기에서는 제한된 지면상 자세한 설명을 생략하기로 한다.

 

다종 방선균의 분리
일반적으로 토양에 존재하는 미생물 중 3-5%만이 분리, 이용되고 있다고 한다(9). 따라서 자연계에는 아직까지 이용되지 않은 미지의 방선균이 많이 존재하고 있다. 성공적인 탐색을 위해서는 효과적인 스크리닝 방법과 연계한 방선균의 분리가 필요하다. 그리고 전항에서 언급한 바와 같이 분리된 방선균에 있어서 중복성이 낮아야 한다. 생리활성물질을 스크리닝 할 경우, 스크리닝 방법이 아주 독창적이거나 선택적일 때에는 분리 이용하는 방선균이 다소 중복적이어도 큰 문제가 되지 않을 수 있다.
그러나 그렇지 않을 때에는 가능한 한 다양한 균 분리원을 활용하고 각 균분리원으로부터는 그 속에 존재하는 방선균을 중복적이지 않으면서도 다종류의 방선균이 분리되도록 하여야 한다. 그리고 스크리닝 속도도 중요할 것이므로 스크리닝의 대상으로서 신 종 또는 희소방선균만을 고집하여서도 곤란할 것이다.
본 저자는 이러한 관점 하에서 다양한 방선균을 분리하고자 연구하고 있으며, 이렇게 분리된 균주는 적절하게 배양하여 필요로 하는 연구자들에게 공급하고 있다. 이 지원사업은 과학기술처 주관의 선도기술개발 연구과제의 하나로서, 1994년 8월부터 “신기능 생물소재 공통기반 기술지원” 개발 사업으로 수행되고 있으며 이미 많은 연구자들이 연계 활용하고 있다.
다음에 스크리닝 목적에 적합한, 그리고 중복성이 낮으면서도 다양한 방선균을 분리하는 방법에 대하여 소개해 보고자 한다. 방선균으로부터 신물질을 탐색하고자 할 때 균분리시 중요한 요소로서는 1) 균 분리원의 적절한 선정 및 시료 채취 2) 물리적 또는 화학적인 시료 전처리 3) 영양적, 생리적인 면을 고려하거나 적당한 저해제를 첨가한 선택적인 균 분리 배지의 사용 4) 적절한 배양 조건 및 배양 기간의 선택 5) 육안 또는 현미경 하에서의 효율적인 균 선별 등을 들 수 있는데, 이들 각 항목에 대하여 하나씩 살펴본다.


균 분리원의 선정
방선균은 그 대사 산물과 형태가 다양한 만큼이나 분포하는 장소도 아주 다양하다. 즉 토양을 비롯 하천, 바다, 조류 또는 식물의 근권 토양이나 부엽토 같은 식물 재료, 동물의 내장, 배설물, 표피, 혈관 등의 동물 재료, 공기중, 생활 하수 등의 폐수 등 거의 모든 자연계에 존재하고 있다(10).
Actinoplanes, Rhodococcus, Micromonospora, Streptosporangium, Nocardia 속의 방선균은 하천, 해양 등 주로 수분이 많은 시료에 많이 분포하고 있으며 Actinomadura, Faenia, Thermoactinomyces, Thermomonospora 속의 방선균은 주로 퇴비 등에 Actinosynnema, Frankia, Nocardia 속의 방선균은 나뭇잎 등 식물 재료에 Actinomyces, Dermatophilus, Nocardiopsis 속의 방선균은 동물 재료에 많이 분포하고 있다(9).
이러한 수평적인 분포뿐만 아니라 수직적 분포도 중요하다. 즉 Takahashi 등이 연구한 결과(11)에 따르면 지하 40 m 까지 조사하였을 때, 수직적인 분포에 있어서 대부분의 방선균은 지하 1 m 이내에 존재하며 특히 지표면에서 10 cm 이내에, 분포 밀도로서 80% 이상이 존재한다고 하였으며 깊이에 반비례하여 그 수는 점차적으로 줄어들고 있다. 지하 1 m 까지 10 cm씩 각 층별로 상이한 방선균의 수를 비교하였을 때, 깊이에 반비례하여 줄어들지만 각 층별로 상이한 방선균의 종류가 많이 존재함을 알 수 있다. 또한 Woodruff의 연구 결과(12)에 의하면 토양 중에 존재하는 방선균의 종류에 있어서 수평적인 변화보다는 토양 깊이에 따른 수직적 변화가 훨씬 크다고 하였다.
식물의 근권 토양인 경우에는 비 근권 토양에 비하여 그 차이는 더욱 현저하다고 하였다. 그리고 박 등이 연구한 결과(13-15)에 따르면 같은 지역 또는 같은 지점의 토양이라 하더라도 계절적인 요인을 비롯한 환경의 변화에 따라서도 큰 차이를 나타내며, 시료 채취 후의 시료 보관 상태에 따라서도 달라질 수 있다. 따라서 생리활성물질 탐색을 위한 균 분리원으로서는 토양 시료가 가장 적당하다고 할 수 있으나 가능한 한 다양한 자연계 시료를 이용하는 것이 바람직하다.
기타 아래에 소개하는 저자들의 몇가지 연구결과를 참고하여 방선균 분리시 활용하기 바란다.

 

토양특성에 따른 다양한 희소방선균의 분리
충남 청원군 소재의 삼림, 강가, 논, 초지, 밭 등에서 봄철에 총 25점의 토양시료를 채집하고 방선균을 분리하였다. 그 결과 표 1과 같이 분리된 방선균주의 수로서는 밭토양에서 53균주로 가장 많이 분리되었고 초지에서 50균주, 논토양에서 40균주, 삼림토양에서 33균주로서 다음으로 많이 분리되었으며 강가토양에서는 26균주로서 상대적으로 적은 수가 분리되었다. 분리된 방선균을 genus별로 보면 Streptomyces가 172균주(85.1%), Micromonospora가 11균주(5.4%), Nocardioform 군이 4균주(2.07%), Actinomadura와 Streptosporangium이 각각 3균주(1.5%) Microbispora가 4균주(2.0%) 등의 순으로 분리되었으며, 토양특성별로는 큰 차이점은 없으나 희소방선균의 분리빈도가 조금씩 상이하였다. 따라서 효율적으로 다양한 종류의 방선균을 분리하고자 하는 경우에는 1차적인 균분리원으로서 밭, 초지, 논, 삼림토양 등 여러 가지 토양환경별로 이용하는 것이 유리하다고 하겠다.

 

제주도 토양 방선균의 속 다양성 분포
제주도 전역에서 채집한 59점의 토양시료로부터 총 938주의 방선균을 분리하였다. 분리된 각 균주의 형태적, 생리적 특성을 조사하고 이를 기준으로 속명을 동정하므로 써 제주도 지역 토양 방선균의 속 다양성을 비교하였다.
그 결과 표 2와 같이 Streptomyces속 방선균이 61.4%를 차지하였으며 Micromonospora속은 16.1%, Nocardioform군은 13.1%, Actinomadura속은 2.0%, Microbispora속은 1.2%, Nocardiopsis속은 2.0%, Streptosporangium속은 0.7%, 나머지 기타속은 3.5% 이었다. 토양 환경별로 보면, 초지 에는 Streptomyces속과 Microbispora속 균주가 풍부하였고, 밭에는 Streptomyces속과 Micromonospora속 균주가 풍부하였고, 산림에는 Micromonospora속과 기타 속 균주가 풍부하였으며 기타 지역과 더불어 방선균의 속 다양성이 풍부한 편이었다. 그리고 기타 환경에서는 표 3과 같이 특히 자연 동굴 토양에서는 Streptomyces속의 분포 비율이 높지 않았으며 상대적으로 Nocardioform군 균주의 분포 비율이 특히 높았다.

 

결과를 보면 Bennet's agar 배지는 glycerol-asparagine agar 배지 및 humic acid-vitamin agar 배지와 각각 8.3% 및 16.7%의 중복도를 나타내었고 glycerol-asparagine agar 배지는 Bennet's agar 배지 및 humic acid-vitamin agar 배지와 각각 10.6% 및 14.9%의 중복도를 나타내었고 humic acid-vitamin agar 배지는 Bennet's agar 배지 및 glycerol-asparagine 배지와 각각 10.4% 및 9.1%의 중복도를 나타내었다. 따라서 실험에 사용한 세 가지 배지 중 2종류의 배지를 사용하여 방선균을 분리하면 배지 상호간 중복 균수의 비율은 평균 11.7% 정도이고 3종류를 모두 다 사용하였을 때는 25% 정도의 균주가 중복하여 분리되었다.
이와 같이 여러 종류의 균 분리용 배지를 사용한다면 사용한 배지의 종류에 따라서 분리되는 방선균의 총 수 및 상이한 균주의 수도 증가하지만, 상대적으로 중복되어 분리되는 균수도 증가하게 되므로 연구 목적에 맞는 배지와 배지 수를 함께 검토하여야 할 것이다. 여러 종류의 균 분리용 배지를 사용하면 분리된 균주 중 중복 균주를 제거하는 단계가 필요하겠지만, 일반적으로 한 종류의 균 분리용 배지를 사용하는 것보다는 2~3종류의 균 분리용 배지를 사용하는 것이 효과적일 것으로 판단된다.


적절한 배양 조건 및 배양 기간의 선택
앞에 열거한 여러 가지 방법을 한가지 또는 잘 조합하여 방선균의 분리를 행하게 되겠지만, 이외에도 배지의 pH 또는 염 농도의 조절, 배양 온도, 배양 기간에 따라서도 서로 다른 방선균을 분리해 낼 수 있다. 즉 pH의 조절에 의해 호산성이나 내산성 또는 호알칼리성이나 내알칼리성균을, NaCl 등이 고농도로 함유된 배지를 사용함으로써 호염성 및 내염성균을 선택적으로 분리할 수 있고 배양 온도를 조절함에 따라 저온성균 또는 고온성 및 내열성 균을 선택적으로 분리할 수 있을 것이다.
방선균의 분리는 일반적으로 고체 배지 상에서 약 2주간 배양한 후에 실시하지만, 2개월 이상의 장기간 배양하므로서 생육이 느린 방선균을 선택적으로 분리할 수도 있다. 이렇게 장기간 배양하여 나타나는 방선균 중에는 희소방선균의 분리비율이 높아진다. 그러나 이러한 경우 균 분리가 성공적이었다 하더라도, 액체 배양 시에도 균 생육이 느리거나 발효가 쉽지 않은 것이 일반적이므로 특별한 배지의 개발 등 선택적인 배양 방법을 개발해야만 하는 난점도 있다.

 

경험적 요소와 효율적인 균 선별 작업
이상의 방법에 의해 고체 배지 상에 나타난 다양한 방선균의 코로니를 일반적으로 육안 및 장거리 촛점 작동(long working distance) 대물 렌즈를 장착한 광학 현미경 하에서 관찰하여 상이한 방선균을 선별 분리하게 된다.
Bergey's manual of Systematic Bacteriology(1)에 나타난 Streptomyces속 균종의 동정에 필요한 기준을 항목별로 정리해 보면 표 10과 같다. 총 15개 항목 139 항 중 육안 및 현미경적인 방법으로 판정 가능한 것은 형태적 특성 중 1, 3, 4, 5, 6, 7 항목 등 총 31항에 이른다. 기타 생리적인 특성 중 각종 생리활성, 생육 특성 등 약 20 여항도 스크리닝의 초기 단계에 판별할 수 있으므로 이러한 가능한 방법을 모두 활용한다면 더욱 효율적으로 균 선별을 할 수 있을 것이다.

 

Characters Items
Morphology and pigmentation
1. Spore chain morphology
2. Spore surface ornamentation
3. Other morphological features
4. Color and spore mass
5. Pigmentation of substrate mycelium
6. Diffusible pigments
7. Melanin pigment production

Physiology
1. Antimicrobial activity
2. Enzyme activity
3. Degradation activity
4. Resistance to antibiotics
5. Growth temperature and pH
6. Growth in inhibitory compounds
7. Use of nitrogen sources
8. Use of carbon sources 

 

방선균은 자연계에 널리 분포하고 있고 학문적으로 흥미롭거나 산업적으로도 유용한 경우도 많으나, 실제 자연계에 있어서의 정확한 분포 및 그 역할은 아직 잘 알려져 있지 않다. 적절한 균 분리원의 선택 및 이로부터의 신 종 또는 유용한 방선균만을 효율적으로 분리하는 방법은 아직까지 다소 논의의 여지가 있지만 자연계에는 아직 미지의 유용한 방선균이 많이 존재함에는 이의가 없다.
따라서 스크리닝 목적과 연계하여 방선균을 효율적으로 분리하고 이용하는 기술이 향상되면 스크리닝 연구는 보다 더 성공적일 것이다. 지금까지 이에 필요한 적절한 균 분리원의 선정, 시료의 전처리, 적절한 배지 등의 선정, 배양 조건의 검토 및 효율적인 균 선별 등에 대하여 간략하게 검토해 보았다. 앞으로 방선균 연구에 있어서, 생태학적인 연구 및 분자 생물학적인 연구의 발전을 통하여 신물질 탐색의 효율성은 더욱 높아질 것으로 보여진다.


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