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미생물이야기 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)
2013-08-16 16:40:23
이엠생명과학연구원

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)

 

 

가. 배지
(1) 3배 농후 아스파라진배지 (추정시험용배지)

 

아스파라진 DL

9.0 g

인산1수소칼륨

3.0 g

황산마그네슘(7수염)

1.5 g

1.0ℓ

 

상기 성분을 물 1ℓ에 넣고 가열 용해하여 실온에서 pH가 7.0±0.2가 되도록 조정한 다음 대시험관에 25ml 씩 나누어 넣고 121℃에서 15분간 고압 증기멸균한다.

 

(2) 아세트아미드배지 (확정시험용배지)

 

아세트아미드

10.0 g

염화나트륨

5.0 g

인산1수소칼륨

1.39 g

인산2수소칼륨

0.73 g

황산마그네슘(7수염)

0.5 g

페놀레드

0.012 g

1.0ℓ

 

상기 성분을 물 1ℓ에 넣고 가열 용해하여 실온에서 pH가 7.0±0.2가 되도록 조정한 다음 소시험관에 10ml 씩 나누어 넣고 121℃에서 15분간 고압 증기멸균한다.

 

(3) 아세트아미드 한천 사면배지 (확정시험용배지)

 

아세트아미드

10.0 g

염화나트륨

5.0 g

인산1수소칼륨

1.39 g

인산2수소칼륨

0.73 g

황산마그네슘(7수염)

0.5 g

페놀레드

0.012 g

한천

15.0 g

1.0ℓ

 

상기 성분을 물 1ℓ에 넣고 가열 용해하여 pH가 7.0±0.2가 되도록 조정한 다음 중시험관에 약 8ml씩 분주하고, 121℃에서 15분간 고압증기멸균한 후 사면이 형성되게 응고시킨다.

 

(4) 트립틱 소이 증균배지

 

카제인 췌장액 분해산물

17.0 g

대두분말 파파인 분해산물

3.0 g

염화나트륨

5.0 g

인산2칼륨

2.5 g

포도당

2.5 g

상기 성분을 물 1ℓ에 넣고 완전히 녹인다. 121℃에서 15분간 고압증기멸균한 후 멸균된 페트리 접시에 약 15㎖씩 무균적으로 분주한 후 굳힌다.

 

나. 기구 및 장치
(1) 기구 및 장비는 대장균군시험과 동일한 것을 사용한다. 이밖에도 다음의 기구 및 장치가 필요하다.
(2) 자외선 램프(장파장 365nm조사)
(3) 자외선 방호안경

 

다. 시험 방법

샘물 및 먹는샘물에 대한 녹농균 시험은 다음 3단계로 실시한다.


(1) 추정시험

검수 50ml씩을 3배 농후 아스파라진배지가 25ml씩 들어 있는 시험관 5개에 각각 접종한다. 검수를 접종한 아스파라진배지는 35±0.5℃에서 24±2시간 배양후 암실에서 자외선 방호안경을 끼고, 자외선램프로 장파장의 자외선(365nm부근)을 조사해서 녹색을 띠는 형광의 유무를 관찰하고, 형광이 발생한 경우 추정시험 양성으로 한다. 다만, 명확한 형광이 확인되지 않는 경우는 배양을 더 지속해서 48±3시간까지 관찰한다. 이때 시험관에서 녹색 형광이 확인되지 않는 것은 녹농균 음성으로 인정한다.

시험관에서 녹색 형광이 인지되는 경우는 추정시험 양성으로서, 녹농균의 존재 여부를 확인하기 위해 다음의 확정시험을 계속해서 실시한다.

※참고 : 녹색 형광이 현저한 경우는 밝은 실내에서 자외선을 조사하지 않아도 육안으로 양성이라는 것을 대략 확인할 수 있다.

 

(2) 확정시험

추정시험에서 녹색을 띠는 형광을 확인한 모든 시험관에서 바로 백금이를 이용하여 양성 배지의 상층부에서 3회(약 0.1ml) 취하여 각각의 아세트아미드배지 또는 아세트아미드 한천사면배지의 사면에 골고루 이식하여 35±0.5℃로 24∼36시간 배양한다. 배양 후 아세트아마이드 한천사면배지에서도 배지에 현저한 색깔 변화가 없는 경우는 녹농균 음성으로 한다. 그러나, 1개의 시험관이라도 적자색을 나타내는 것은 확정시험 양성으로 판정한다.

 

(3) 확인시험

확정 양성집락을 순수분리한 후 트립틱 소이 증균배지 혹은 유사배지에서 41.5±0.5℃로 48시간 배양하여 성장여부를 관찰한다. 성장하지 않는 집락은 녹농균 음성으로 판정하고 성장한 집락은 그람음성간균임을 그람염색 후 현미경 관찰로 확인한 후 API 20NE와 같은 상용화된 동정시험 Kit나 VITEK같은 새균동정기를 사용하여 동정하거나 아래에 명시된 생화학적 특징을 검사한다. 생화학적 확인시험에서 녹농균으로 동정되면 녹농균 양성으로 판정한다.

 

※ 생화학적 특성(다음의 조건을 동시에 만족시켜야 함)

oxidase(+)

42℃성장 및 4℃성장 불가능

catalase(+)

수용성 형광색소형성(98%정도)

oxidative metabolisms in Hugh & Leifson test

nitrate reduction

젤라틴(gelrtin)이용

카제인가수분해(casein hydrolysis)

전분이용 불가능

pyocyanine 색소발생




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