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미생물이야기 혐기성세균 군별분류에 따른 당의 이용형식(산화 또는 발효)으로 중요시 되고 있다.
2013-08-19 09:43:00
이엠생명과학연구원

혐기성 세균

 

혐기성 세균의 동정시 속을 분류하는 기준은 형태, Gram염색성, 발효생산물 등이다.

이들 세균은 분자형 산소를 이용하지 않고, 에너지대사결과 어느 정도의 유기물을 남기기 때문에 이 물질의 동정 또는 정량이 군별분류에 이용된다. 이러한 점은 혐기성세균 군별분류에 따른 당의 이용형식(산화 또는 발효)으로 중요시 되고 있다.

 

1. 배지

혐기성 세균을 계수, 분리하는데 사용되는 배지는 beef-extract 한천배지, PY배지, VL배지, albumin배지 등이 있다.

또한 특수한 기능을 갖는 혐기성세균을 분리하는데는 황산환원균 분리배지, 질소고정균 분리배지와 cellulose분해균 분리배지 등이 이용된다.

 

2. 생균수 계수와 혐기성 배양법

① 토양시료를 건토로서 약 1g취한다.

② 시료를 auto-clave 멸균(120℃, 15분)된 희석액100㎖가 들어 있는 삼각플라스크에 넣고 격렬하게 교반한다.

③ 교반 후 현탁액 1㎖를 9㎖의 희석액에 순차적으로 넣어 잘 교반하며 각각의 희석단계별 현탁액을 만든다.

④ 이 토양희석현탁액을 Petri-dish에 피펫으로 넣고 한천배지를 부어 굳힌 후 혐기적으로 배양한다. 30℃에서 10∼14일간 배양한 뒤 배지에 생육한 colony를 계수한다.

⑤ 이 조작을 할 때는 단시간내에 처리하며 혐기성 세균이 공기에 접촉하는 시간을 짧게 한다.

⑥ 이상의 방법은 토양 중의 세균을 분리하는 일반적인 방법이지만 편성혐기성세균(편성혐기성세균)을 분리할 때는 혐기상태하에서 희석하는 것이 좋다.

혐기성세균의 배양법으로는 공기중의 산소를 제거하는 방법이나 질소, 수소, 이산화탄소 등으로 공기를 치환하는 방법 등이 있다.

다음은 이들 배양법 중에서 토양미생물의 연구에 널리 쓰이는 방법을 기술키로 한다.

- 희   석   액 -

시 약 첨 가 량
NaCl 0.9 g
KCl 0.042 g
CaCl2.6H2O 0.048 g
NaHCO3 0.02 g
Cysteine.HCl 0.2 g
Distilled water 400 ㎖

 

2.1 Roll tube법

목적하는 혐기성 세균을 분리하는데 적합한 배지에 한천 1.5% 와 resazurin 0.0001%(W/V)를 가한다. 배지를 멸균한 다음 한천이 굳지 않는 온도로 보존된 배지에 산소를 제거한 질소가스 혹은 탄산가스 등을 불어넣는다.

이 때 resazurin의 적색이 없어지면 배지는 환원상태로 된 것이다.

- Roll tube제작과 균의 계수 -

적당히 희석된 시료 1㎖를 시험관에 넣는다(시험관은 질소가스분사관을 사용하여 공기를 치환하는 것이 좋다.). 즉 가스를 불어넣으면서 멸균된 배지 9㎖를 피펫 및 분주용 기구를 사용하여 무균적으로 넣는다.

배지를 분주한 후 멸균된 butyl고무마개를 하고 한천이 시험관의 기면에 얇은 피막상태로 굳게 시험관을 수평으로 놓고 회전시켜 배지를 굳힌 다음 30℃에서 10∼14일간 배양 후 colony를 계수 및 분리한다.

이 Roll tube법을 미국에서는 PRAS(Pre-Reduction Anaerobically Sterillized)라고 한다.

 

2.2 Rosental법

금속 크롬과 황산을 반응시키면 용기내의 산소가 제거되고 수소가스가 발생하는 것을 이용하는 것이다.

금속크롬을 잘게 마쇄하여 유리그릇(데시케이터 용량 5ℓ중 크롬이 약 5 g정도)에 넣고, 여기에 15% 황산을 크롬 5g에 대해 약 150∼200㎖가 되게 주입한다.

시료와 한천배지를 넣어 굳힌 페트리 접시와 혐기도지시약(indicator)가 담긴 시험관과 황산크롬이 담긴 용기를 데시케이터에 넣고 밀봉한 후 진공펌프로 데시케이터 내의 공기를 제거한다.

데시케이터 내의 공기가 감소하면 크롬과 황산이 반응하여 수소가스를 발생시키는데 진공조작시간은 20∼30분이면 충분하다. 이것을 30℃에서 10∼14분간 배양한 후 colony를 계수,분리한다.

- 혐기지시약(indicator) 제조 -

첨가 시약

① 6% glucose수용액

② 0.1N NaOH 6㎖를 증류수 100㎖에 희석

③ 0.5% methene blue 3㎖를 증류수100㎖로 희석

위 세가지 용액을 동량혼합한 후 시험관에 지시약을 넣고 끓여 청색에서 무색이 되기 직전에 데시케이터 내에 넣는다.

배양기가 혐기상태이면 무색이지만 산화되면 청색을 나타낸다.

 

2.3 Rosenthal 개량법

Roeanthal법에서의 순수한 금속크롬대신에 Cr3+를 아연(Zn)으로 환원하는 것이다.

- 조작 -

a. 과립금석아연(3.3g/진공데시케이터 1ℓ)

b. 탄산칼슘 (0.23g/진공데시케이터1ℓ)

c. CrK(SO4)2 100g을 증류수에 녹이고 진한 황산 120㎖를 가한다. 이 용액은 진공데시케이터 1ℓ당 20㎖를 사용한다.

유리병에 a, b, c를 차례대로 가한 뒤 데시케이터에 넣고 진공조작을 한다.

- 지시약 -

(1) 0.2M Phosphate buffer solution

(The final concentration of indicator is 0.04% in buffer)

(2) Ascorbic acid 0.5%(W/V)

(3) Agar 0.6%(W/V)

………… 1㎖

 

………… 1㎖

………… 8㎖

뜨거운 한천용액(3) 8㎖를 시험관에 넣고 지시약 (1)과 (2)를 가한 뒤 방냉한다. Gel상으로 굳은 용액을 배양기에 넣고 사용한다. 산화되면 청색이 나타날 때까지 열을 가해 환원상태로 한 후 사용한다.

 

2.4 Steel wool법

- 재료 -

Steel wool(10g/3ℓ desicator)

95 ㎖

Activation solution

 

CuSO4.5H2O

2.5∼5 g

Tween 80

2.5 g

Distilled water

1,000 ℓ

PH1.5∼2.0 (1N H2SO4)

 

- 조작 -

Steel wood(시중의 철수세미) 10g을 황산동용액 500㎖에 담근다. 용액이 어두운 회색이 되어 용액의 동색이 없어질 때까지 충분히 담가둔다. 이렇게 하면 steel은 적동색이 된다.

일반적으로 혐기성세균의 생육은 탄산가스가 있을 때 양호하므로 탄산마그네슘과 NaHCO3를 동량혼합하여 5g을 비이커에 넣고 물 10∼15㎖를 넣어 CO2를 발생시키는 것이 좋다.

지시약은 Rosenthal법에서 사용된 것을 이용하며 진공펌프로 데시케이터 내의 공기를 제거한 후 30℃ 항온실에서 10∼14일간 배양한 후 생육된 콜로니를 계수 또는 분리한다.

 

3. Clostridium의 계수

Clostridium은 광범위하게 토양에 분포하며, 포자를 형성하는 혐기성세균의 일종이다. 균종에 따라 세포의 중앙에 포자를 형성하는 것( Clostridium type)과 세포말단에 형성하는 것 (Plectridium type)으로 분류되며 이들의 포자는 내열성이 있다.

- 조작 -

① 토양희석 현탁액을 만들어 PY한천배지 또는Clostridium 선택배지에 접종한 후 30℃에서 10∼14일간 혐기배양한다.

② 적당한 수의 colony가 형성된 페트리접시로부터 모든 colony를 백금선으로 떼어내어 사 면배지에 이식하여 혐기배양한다.

③ 사면배지에서 VL배지로 이식하여 30℃에서 4일간 배양한다.

④ 이 배양액 1백금이를 취하여 멸균수가 들어있는 시험관에 옮긴다.

⑤ 이 시험관을 80℃ water bath에서 10분간 넣어둔다.

⑥ 열처리 후 수돗물로 냉각한 후 백금이를 사용하여 배지에 접종한다.

⑦ 이를 30℃에서 4일간 혐기배양한다. 이 때 생육된 균주는 포자형성균이다.

⑧ 포자형성균으로 판정된 균의 사면배지에 3% 과산화수소를 주입하여 catalase시험을 한다. 이 때 가스가 발생하지 않는 것이 catalase 음성이며 이와 같이 판정된 catalase 음성균과 포자형성 여부시험에서 형성균으로 판정된 균이 Clostridium 이다.

 

4. 분리법

호기성 세균의 경우에 잘 사용되는 평판희석법에 시험관을 이용하는 것이다. 즉 혐기성상태하에서 처리한 roll-tube법에 의해 tube상에 나타난 colony를 탄산가스기류하에서 떼어내어 별도로 준비된 사면한천배지에 이식하여 분리한다.

분리 후 호기성조건에서의 생육 유무를 반드시 검사하여야 한다.

 

5. 성상검사

세균의 성상검사는 앞에서 언급한 기본배지에 여러 종류의 물질을 가하여 실시한다. 검사항목, 검출방법의 원칙은 호기성 세균과 크게 다르지 않다.

혐기성 세균의 에너지대사결과 배지 중에 남아있는 여러 유기물 등의 성분에 따라 세균이 분류되므로 유기물 분석이 혐기성 세균 분류에 있어 매우 중요하다.

5.1 유기물 분석

혐기성세균의 주요한 생산물은 저급 지방산, 유산, succinic acid, 저급 알코올 등이다. 이들 물질들은 가스 크로마토그래피에 의해서 쉽게 정성 및 정량분석할 수 있다.

 

5.2 생리검사

  5.2.1 혐기도 검사

PY배지에 0.2% glucose와 0.2% 한천을 가한 배지를 사용한다

이 반고체 배지에 백금선으로 배지의 표면부터 시험관 밑부분까지 찔러 접종한다. 30℃에서 배양하여 생육상을 조사한다. 배지표면부터 밑부분 전체에 걸쳐 생육하는 세균은 통성 혐기세균(facultataive anaerobe), 배지 표면 근처에서만 생육하는 미호기성세균(microaerobic bacteria), 아래 부분에서만 생육하는 편성 혐기성세균(strict anaerobic)으로 구별한다.

이 실험을 할 때에는 배지를 신속히 냉각시켜 산화가 되지 않게 하며, 지시약으로 0.0001% resazurin 지시약을 사용한다.

  5.2.2 당류-자화시험

PY배지에 시험하는 당을 0.5%, 한천을 0.2%가 되게 가하고 0.2% BTB 수용액(12㎖/1ℓ배지)을 가한 배지를 사용한다.

고층한천배지에 백금선으로 공시균주를 접종하여 30℃에서 4일간 배양한다.

경시적으로 가스생성, 당의 생성을 관찰한다. 가스는 기포로 반고체 배지 가운데서 생성된다. 산의 생성은 BTB가 청색에서 황색으로 변하는 유무를 판단하여 자화성을 판단한다.

  5.2.3 Milk응고 및 소화시험

탈지우유(skim milk )180g, cysteine.HCl 0.8g을 증류수 1000㎖에 녹인다. pH를 7.2∼7.4로 조정한 다음 Auto-clave로 멸균(110℃, 20분)한 후 공시균주를 접종하여 경시적으로 milk의 응고 및 소화를 관찰한다.

  5.2.4 Gelatin의 소화

PY배지에 glucose 0.2%, gelatine 12%가 되게 가한 후 110℃, 15분간 auto-clave에서 멸균한다.

Gelatin 배지에 공시균주를 접종한 뒤 혐기배양한다. 30℃에서 7일간 배양한 뒤, 수돗물로 30분간 냉각시킬 때 고화되지 않고 액화될 때 gelatin 액화능이 양성이다.

  5.2.5 황산수소생성

0.2% PY한천배지 1000㎖에 황산제1철 0.2g, 티오황산나트륨 0.3g을 가한 배지를 사용한다.

auto-calve로 120℃, 10분간 멸균한 후 배지에 공시균주를 접종한 뒤 30℃에서 4일간 배양한다. 황화수소가 생성되면 배지가 흑색으로 변한다.

  5.2.6 질산염 환원

PY배지에 0.2% glucose, 0.5% 질산나트륨, 0.2% 한천을 가한 배지를 이용하며, 110℃, 15분간 Auto-clave에서 멸균한다. 배지에 공시균주를 접종하여 30℃에서 4일간 배양한다.

아질산 검출은 0.8% sulfanilic acid의 5N초산용액, 0.5% α-나프틸아민의 5% 초산용액을 차례대로 가한다. 용액 내에 아질산이 존재하면 적색으로 나타난다.

  5.2.7 Indole 생성

PY배지에 0.2% 한천을 가한 배지를 사용한다. 120℃, 10분간 auto-clave에서 멸균한 후 공시균주를 접종한 후 30℃에서 4일간 배양한다.

Indole 검출은 Kovac시약을 이용하며 Indole이 생성되면 적색이 나타난다.

Kovac시약은 호기성 세균의 Indole생성시험을 참조한다.

  5.2.8 Catalase 시험

PY배지에 0.2% glucose, 2% 한천을 가한 사면배지를 이용한다.

110℃, 15분간 auto-clave 에서 멸균하여 배지에 공시균주를 접종하고 30℃에서 4일간 혐기적으로 배양한다.

검정법은 호기성균배양법을 참조한다.

  5.2.9 헤모라이신 시험

- 배지 -

Beef extraction

1 g
Peptone 5 g
Yeast extract 2 g
NaCl 5 g
Blood 500 ml
Agar 15 g
Distilled water 1,000 ml

혈액을 제외한 성분을 가온, 용해시킨 후 pH를 7.2로 수정하고 Auto-clave 멸균한다. 배지를 50∼55℃로 보전하고, 무균적으로 혈액을 가한다. 혈액은 멸균된 말 혈액을 이용한다.

무균적으로 배지를 페트리 접시에 넣고 고화시킨 후 배지 표면에 세균을 도말배양한다. 헤모라이신을 함유하면 colony주위의 혈구가 용해된다.

  5.2.10 Acetone, Aldehyde, Alcohol검출

PY배지에 0.5% glucose를 포함시킨 배지를 이용한다. 110℃, 10분간 auto-clave에서 멸균한다.

200㎖의 배지에 공시균주를 접종하고 30℃에서 4일간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한다. 상등액 100㎖를 1N NaOH를 사용하여 약 알칼리성으로 한 후 증류수 20㎖를 가하여 증류시켜 유액 100㎖를 받는다.

 

(1) Acetone 검출

유액 5∼10㎖를 시험관에 취하고 유안결정을 가해 포화시킨다. 여기에 새로 제조한 sodium nitrprusside (5% 수용액) 2∼3방울과 진한 암모니아수 1∼2㎖를 첨가하여 20분 후에 자색이 나타나면 양성이다.

(2) Aldehyde검출

유액에 암모니아성 질산은용액을 가한다. 알데히드를 함유하면 환원되어 흑색으로 혼탁해지거나, 침전 또는 은경을 생성한다.

- 암모니아성 질산은 용액 -

AgNO3

10 g
Ammonium water 3㎖
NaOH(10%) 30 ㎖

(3) Alcohol검출

유액 1㎖에 몰리브덴산 황산액 2∼3㎖를 가하고 가열한다. ethanol을 함유하면 청색을 나타낸다. 몰리브덴산 황산액은 몰리브덴산을 진한 황산에 녹인다.

  5.2.11 휘발성 지방산의 생성

PY배지에 0.5% glucose를 가한 배지를 이용하여 110℃에서 15분간 auto-clave멸균한다.

배지에 공시균주를 접종하고 30℃에서 4일간 배양한다.

배양액 5㎖에 대해 m-phosphoric acid(5N 황산에 25%가 되게 희석) 1㎖를 가하고 30분이 지나면 원심분리하여 상등액을 gas chromatography로 분석한다.

  5.2.12 비휘발성균의 생성

유기산을 methyl ester화 하여 gas chromatography로 분석한다. 휘발성유기산과 마찬가지로 메타 인산처리된 상등액을 사용한다.

소형시험관에 상등액 1㎖를 취하고 실린더형 진공 데시케이터에 넣고 동결건조한다. 건조 후 즉시 불화붕소, 메탄올용액 0.1㎖를 가하여 100℃ 끊는 물에서 4분간 가온시킨다. 가온 후 수돗물로 30초간 냉각한다.

냉각 후 클로로포름.메탄올(14:1)용액0.5㎖를 가한 후 ester화 된 유기산의 분리를 위해 진탕한다. 진탕 후 NaOH 0.1㎖를 가하고 다시 재진탕한다. 상층의 클로로포름층을 가스 크로마토그래피로 분석한다.




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