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미생물이야기 C. difficile의 독소는 항균제 관련성 설사와 위막성 장염의 두 증후군과 관련있다.
2013-08-19 09:52:35
이엠생명과학연구원

Clostridium difficile 

 A.임상적 의의
 

 C. difficile는 아포 형성 통성 혐기성 그람양성세균으로서 병원환경 내에서 기회감염균으로 작용한다. C. difficile의 독소는 항균제 관련성 설사와 위막성 장염의 두 증후군과 관련있다. 항균제 사용으로 장내 상재균 분포가 변화되면 상재균에 억제되어 있던 C. difficile이 과성장되어 감염을 일으킨다. C. difficile에 의한 설사 및 위막성 장염은 penicillin, cephalosporin, clindamycin과 같은 항균제뿐만 아니라 azidothymidine과 methotrexate 등의 항균 작용이 있는 약제에 의해서도 발생한다. C. difficile에 의한 설사는 사용하던 약제를 끊기만해도 멈추는 경우가 있으며 증상이 계속되거나 심할 때에는 경구로 vancomycin 또는 metronidazole을 투여한다. 대부분의 C. difficile 분리 균주는 vancomycin, metronidazole, rifampin, bacitracin 등에 감수성 결과를 보이나 일부 균종은 metronidazole 내성이다. 일반적으로 C. difficile의 항균제 감수성 시험은 환자의 치료 방침을 결정하는데 도움을 주지 못한다. C. difficile의 병독성 인자는 장내독소 (toxin A)와  세포독소 (toxin B)이며 한가지 독소만 있는 C. difficile는 없다. C. difficile에 의한 위막성 장염의 임상적 진단 기준은 항균제 사용 후 설사가 있으며 다른 원인균은 분리되지 않고 적절한 항균제 치료에 반응이 있으며 내시경 검사로 위막이나 미소 농양을 확인하는 것으로서 내시경 검사가 가장 정확한 진단법이다. C. difficile 관련성 설사의 검사실 표준 진단 방법은 조직배양에서 세포독소 (toxin B)를 검출하는 것이다. 그러나 이 방법은 일반 세균검사실에서는 이용하기가 어렵기 때문에 배양검사로 C. difficile를 분리하거나 상품화된 장내독소 시험법을 많이 사용한다. C. difficile는 정상인의 3%, 입원환자의 약 20%에서 상재할 뿐만 아니라 모든 C. difficile이 독소를 생성하지는 않기 때문에 배양법은 특이도가 낮은 진단법이며 상품화된 장내독소 시험법은 표준 진단법에 맞먹는 예민도와 특이도를 보인다.  
 

 

B. 배양법 
   

ⓐ CCFA (cycloserine-cefoxitin-fructose-egg yolk) 선택배지
        ㉠ C. difficile은 산소에 매우 예민하므로 혐기성 상태에서 CCFA 평판에 접종한다. 상품화된
            배지를 포함하여 사용하는 모든 배지는 정도관리를 시행해야 한다.
        ㉡ 평판을 35-37℃에서 48시간 배양한 후 집락이 크고 유백색의 광택이 나는 황색 집락을
            찾는다. 집락은 "마굿간" 냄새가 난다.  
    

ⓑ 동정
          ㉠ Wood 램프 자외선에서 황녹색 형광을 확인한다.
          ㉡ 그람염색에서 특징적인 형태가 있는지를 관찰한다.
          ㉢ 예비 동정 후 각 검사실의 혐기성 동정 방법에 따라 확정 동정을 시행한 다음 "C. difficile
              배양 양성 (C. difficile isolated)"로 보고한다.


 
 
 C. 라텍스 응집 시험
  

 이 시험은 장내독소 (toxin A)를 검출하는 방법으로 술식이 간단하고 결과보고가 빠르며 특별한 장비나 숙련도가 필요없는 장점이 있다. 시험 방법은 제조회사 (Culturette brand, CDT Latex Test, BD Microbiology Systems)의 지시대로 시행하며 비독소를 생성하거나 교차반응을 보일 수 있는 C. difficile, Clostridium botulinum, Clostridium sporogenes, Peptostreptococcus anaerobius 및 Bacteroides asaccharolyticus 균종은 위양성 결과를 초래한다. 결과 보고는 음성이면 "C. difficile 연관성 항원 음성 (No C. difficile-associated antigen detected)"로, 양성이면 C. difficile 연관성 항원 양성 (C. difficile-associated antigen detected)"로 보고하고 양성 결과는 조직 배양으로 확진한다.
 

D. 내독소 (독소 A) 검출  
    ⓐ Dot immunobinding 법
        시험 방법은 제조회사의 지시대로 시행한다. 일반적인 시험 순서는 다음과 같으며 C. dificile
        연관성 설사의 신속한 선별 진단법으로 이용될 수 있다.
        ㉠ 분변 용액 상청액을 필터가 있는 막 카세트 (membrane cassette)에 넣는다.
        ㉡ 필터를 제거하고 단클론 항체를 막 표면에 첨가한다.
        ㉢ 배양 후 horse-radish peroxidase와 결합된 anti-mouse IgG를 막표면에 첨가한다.
        ㉣ 세척액을 막 표면에 넣고 기질 시약을 첨가한 후 막 표면이 청색 또는 청록색을 띠는지 확인
            한다.
    ⓑ 효소면역법
        ㉠ 효소면역법은 항독소 A 포획 항체가 흡착되어 있는 microwell에 효소가 결합된 항독소 A의
            단클론 항체와 희석된 변 검체를 시험 well에 넣고, 35-37℃에서 2시간 배양한다.
        ㉡ 세척한 후 기질을 well에 넣고 실온에서 10분간 배양한다.
        ㉢ 반응 정지 시약을 넣고 육안적 또는 분광광도계로 흡광도를 관찰한 후 양성이면 "C. difficile
            독소 A 양성 (C. difficile toxin A detected)"로 보고한다. 제조회사에 따라 시험 방법이
            다르다. 
 
 
 E.세포독소 (독소 B) 검출
 

 조직배양 세포독소 시험은 C. difficile 관련성 설사의 표준 진단 방법이다. 조직배양 세포독소 시험은 조직배양에 24-48시간이 소요되고 검사술식이 복잡하며 제반 시설이 필요하므로 일반세균검사실에서는 사용이 어렵다. 참고검사실이나 공인기관에서 주로 실시한다.
 
 
  표준 조직배양법
세포 제거 분변 여과액만 넣은 한 개의 관과 세포 제거 분변 여과액과 C. difficile 또는 C. sordellii 항독소를 함께 넣은 관을 cell line에 동시에 접종한 다음 24-48시간 후에 cytopathic effect (rounding of the cell)를 관찰한다. 여러 가지 cell line이 사용되고 있으나 사람의 diploid fibroblast cell line이 cytopathic effect가 뚜렷하기 때문에 가장 흔히 사용된다. Cell line은 바닥이 평평한 96 well microtiter plate에 증식시킨다. 분변내에는 C. difficile 독소의 cytopathic effect의 형태적 변화를 일으키는 독소가 있으므로 항독소 중화시험으로 확인한다. 환자의 대변 내에 C. difficile 세포독소가 있으면 세포를 제거한 변 여과액에서만 cytopathic effect가 나타난다. 두 관 모두 cytopathic effect가 없으면 음성이며 두 시험관 모두 양성일 때는 불확실 (equivocal)로 해석한다. 불확실 결과의 원인으로는 대변 내에 C. difficile 독소 양이 너무 많거나 중화되지 않는 세균 독소 또는 바이러스가 있을 때 나타날 수 있다. 불확실 결과는 대변 검체를 1:20-1:100으로 희석한 후 재검사한다. 보고 방법은 양성은 "C. difficile 독소 양성 (C. difficile toxin detected)", 음성은 C. difficile 독소 음성 (No C. difficile toxin detected)", 불확실은 "독소 양성, C. difficile 독소 음성 (Toxin detected but no C. difficile toxin)"으로 보고한다.
 
  
 ⓑMicrotiter cytotoxicity 법
Bartel의 cytotoxicity 법은 조직배양 세포가 붙어있는 microtiter tray를 이용하는 키트화된 시험법이므로 일반 검사실에서도 사용할 수 있으며 제조회사의 지시에 따라 시험한다. 원리와 보고방법은 표준 배양법과 동일하며 48시간까지 4-6시간 간격으로 cytopathic effect를 관찰한다.
 




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