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효소enzyme 제한효소 절편길이 다형성 분석 (restriction fragment polymorphism, RFLP)
2013-08-22 17:30:53
이엠생명과학연구원

제한효소 절편길이 다형성 분석

 

제한효소 절편길이 다형성 분석 (restriction fragment polymorphism, RFLP)은 세균 분리균주에 자주 사용되었다. 이 방법은 먼저 세균 분리균주의 순수 배양으로부터 전체 DNA를 추출하는 것으로 구성된다. 이것은 세포 용해와 뒤이은 표준 방법을 이용한 DNA의 유전체 준비를 통해 수행된다. 유전체 DNA는 제한효소 (restriction enzyme)의 사용에 의해 작은 조각으로 절단된다. 이들은 보통 4~6 bp 길이의 특정 DNA 서열들을 인지하는 엔도뉴클레아제 (endonuclease; 핵산내부가수분해효소)이다. DNA의 조각들은 보통 젤 전기영동에 의해 분리된 후 에티디움 브롬마이드 (ethydium bromide) 염색과 UV 조사에 의해 보여진다. 만약 제한효소들이 게놈의 DNA 내에서 여러 부위를 절단한다면, DNA의 조각들이 몇 개 심지어 몇 백 개가 될 수도 있고, 전기영동과 탐침 후 이 조각들의 양상은 본래 세균 분리균주의 지문 특성을 만든다.

 

 

 분석의 장점과 단점

RFLP 분석은 대부분 특정 세균 분리균주를 동정하는데 사용된다. 유전자 탐침 분석과 연계된 RFLP의 가장 큰 장점은 생성된 밴드 양상이 명백하다는 것이다. 이것은 비교적 많은 양의 DNA가 절단되고, 그 결과 생성되는 조각들은 전기영동과 염색 후 쉽게 시각화되기 때문이다. 대조적으로, AP-PCR이나 ERIC-PCR로부터 생성된 것과 같은 PCR-생성 지문들은 재생하기가 어렵고 “faint"나 ”ghost" 밴드를 포함할 수 있으며, 해석을 어렵게 만들 수 있다. 그러나, 사용할 제한효소의 선택은 대개 경험적이고, 보통 여러 효소들이 사용되어야만 한다. 만약 지문이 같다고 해서, 분리균주가 같다는 것을 반듯이 의미하는 것은 아닌데, 그 이유는 하나의 효소가 같은 위치에서 두 개의 준비물을 절단할 수 있기 때문이다.

 

 

변성/온도 구배 젤 전기영동

미생물군집의 다양성 연구에 대한 새로운 접근은 변성 구배 젤 전기영동 (denaturing gradient gel electrophoresis,

DGGE)이나 온도 구배 젤 전기영동 (temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)에 의한 PCR-증폭된 DNA 조각들의 분석이다. 이것은 유전자의 연관 연구에서 점 돌연변이를 검출하기 위하여 의약 연구에서 최초로 개발되었으나 Muyzer 등 (1993)에 의해 미생물 생태학에서 소개되었다. DGGE나 TGGE는 군집 DNA 추출이나 여러 세균 분리균의 혼합으로부터 얻어진 PCR 증폭된 16S rDNA 서열들의 분석에 사용될 수 있다. 보존된 16S rDNA 서열들로부터 고안된 만능의 프라이머 사용은 거의 동일한 길이의, 그러나 다양한 서열 조성을 가진 증폭된 DNA 조각을 생성하게 된다.

분리는 선형 증가 구배의 DNA 변성제 (요소/포름알데히드 혹은 온도)를 포함한 젤에서 이동하는 다른 DNA 조각들의 전기영동적 이동성 변화에 기초를 둔다. 조각 이동성의 변화는 분리된 지역에서 이중 가닥 DNA의 부분적 용해로부터의 결과로서 다른 말로, 변성제나 온도에 저항성이 낮은 부분이 변성을 일으키는 조건에 도달할 때까지 조각들은 이중 가닥으로 남게된다. DGGE 경우에는, 젤의 온도가 일정하게 유지되므로 이 현상이 일어나는데 변성제의 농도에 따라 각 부위의 변성이 변화하고 따라서 젤에 위치한다. DNA가 충분한 변성제를 포함하는 젤의 부분에 들어갔을 때, 나선으로부터 부분적으로 풀어진 분자로의 변화는 DNA 조각의 이동성을 급격히 감소시키는 분자가 갈라지는 결과와 함께 일어난다. 특정 영역 내의 서열 다양성은 그들의 녹는 반응을 변경한다. 그러므로, 다른 PCR 증폭 산물은 변성 구배 내의 다른 위치에서 이동이 멈춘다.

 

DGGE/TGGE의 장점과 단점

일단 분리되면, 특정 조각들은 젤에서 떼어낼 수 있고 서열 결정과 같은 차후의 분석을 할 수 있다. 군집 DNA 추출에 적용된 이 전략은 분리균주의 사전배양 없이 존재하는 주된 16S rDNA들에 대하여 만들어진 평가를 허용한다. 이 기법의 문제에는 군집 DNA 추출과 연관된 실수들을 포함한다. 마지막으로, 각 생물체의 rRNA 오페론 사이의 서열들이 두드러지게 변화할 수 있는 것에 주의하고, 따라서 각 생물체는 구배 젤에서 다중 밴드를 생산할 수 있다. 최종적으로, 이 접근법이 어떤 생물체가 존재하는지에 대한 정보를 제공하지만, 그들의 활성에 관한 정보를 제공하지는 않는다.




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