커뮤니티 > 효소enzyme



효소enzyme 중합효소 연쇄 반응에 대해 알아보자.
2013-08-22 17:31:11
이엠생명과학연구원

중합효소 연쇄 반응

표적 DNA의 양을 106 배 또는 그 이상 증폭하기 위하여 사용되는 기법인 PCR은 분자 생물학 방법론들의 혁명을 가져왔다. 1985년에 처음 발명된 PCR은 환경 미생물학과 관련있는 실험실을 포함하여 많은 생물학 실험실에서 중요한 방법이 되었다. 환경에 존재하는 소량의 DNA를 증폭하는 능력은 매우 민감한 탐지를 가능하게 만들었다. 예를 들면, 전형적인 배양 기법들을 사용하여 토양 1 g에 100개의 Salmonella 세포들의 탐지는 매우 어렵다. 그러나 100개의 세포를 106 세포에 해당되는 것으로 증폭하는 것은 검출을 매우 쉽게 만든다. PCR은 25~30회 주기 동안 반복적으로 표적 DNA 서열을 복사하는 DNA 중합효소를 사용한 간단한 효소적인 반응이다. PCR의 각 주기동안 표적 DNA의 양은 두 배가 되고, DNA의 양이 기하급수적인 증가를 가져오는 결과가 된다. 이론적으로 25회 주기는 225 증폭 결과가 되나, 실제로는 존재하는 표적 서열의 양이 106배 증가를 얻었다. 이것은 증폭의 효율이 완전하지 않기 때문이다. PCR의 산물은 전형적으로 아가로즈 젤 전기영동에 의해 시각화되고 그 크기는 알려진 크기의 표준 DNA와 비교되어 평가된다.

 

특정 유전자의 PCR 검출

앞에서 설명하였듯이, 적절히 제작된 프라이머들은 Rhizobium의 모든 종에서 발견되는 nod 유전자와 같은 관심 있는 유전자 검출에 사용될 수 있다. 다른 예로는 해수에서 E. coli를 검출하기 위해 lamB 유전자에 대해 특이한 프라이머들을 사용한 Marlowe 등 (1997)에 의한 연구이다. Tsai 등 (1993)은 하수와 슬러지에서 E. coli를 검출하기 위해 uidA 유전자 조각 (β-D-glucuronidase를 암호화하는 E. coli 유전자)를 증폭하는데 프라이머를 사용했다. 이전에 토의된 것처럼, PCR은 모든 진핵생물에서 보존된 보편적 16S 리보좀 유전자 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 이 서열의 외부 부분은 매우 높게 보존되었으나 내부 서열은 특정 세균에 유일하다. 보편적 서열로부터 제작된 프라이머들을 사용한 증폭 후, 산물의 내부 서열은 특정 분리균주의 동정을 허락하는 계통발생 분석법에서 사용될 수 있다. 16S rDNA 서열들의 분석은 폭발적인 계통발생 연구들을 가져오는데, 그 이유는 세균 분리균주의 사전 배양 없이 환경 시료로부터 얻어진 전체 DNA 추출물로부터 분석들이 이루어질 수 있었기 때문이다. 대신에, 연구자는 환경 시료 내의 세균 개체군의 군집 DNA를 추출할 수 있고, 추출된 DNA 내의 세균 게놈으로부터 16S 지역을 증폭하며, 이 PCR 산물을 숏건 클론 (shortgun clone)한 후에 클론의 서열들을 분석한다. 서열 결정 전에 다른 PCR 산물을 분리하기 위하여 DGGE가 사용될 수도 있다).

 

PCR의 장점과 단점

PCR은 전통적인 배양 기법들보다 많은 장점들을 가진다. 그것은 더욱 민감하고 그들의 생리적인 상태에 관계없이 모든 생물체들을 검출한다. 일단 PCR 분석이 실험실에서 최적화되면, 그것은 비교적 빠르고 간단해서 24시간 안에 결과를 얻을 수 있는데, 배양 방법들에서는 몇 일이나 몇 주가 걸린다. PCR은 또한 약간의 단점들을 가진다. 어떤 경우에는 생명력이 있는 생물체와 생명력이 없는 생물체를 모두 검출하는 것이 장점이 아니다. 예를 들면, PCR은 하루만큼 짧은 시간에 병원성 바이러스들을 검출할 수 있는 반면에, PCR은 시료가 얼마나 위험한지에 대한 질문에 답하지 못한 채 전염성과 비전염성 바이러스를 모두 검출할 것이다. 대조적으로, 동일한 바이러스들의 세포 배양은 몇 주가 소요될 수 있으나 시료의 전염성에 대한 정보를 제공할 것이다. 추가적으로, PCR은 환경 시료에 존재할 수 있는 금속과 부식질 때문에 저해받을 수 있다. 오염도 또한 문제가 될 수 있는데 PCR을 사용하여 가짜 양성 결과가 나올 수 있다. 그것의 단점에도 불구하고, PCR은 이전에 해결이 불가능했던 의문들을 환경 미생물학자들이 조사하는 것을 허용하게 되었다. 특히, 전통적인 기법들과 협력하여 사용된 PCR은 환경 미생물학에 관련된 중요한 의문들을 다음 세대의 미생물학자들이 착수하게 허락하는 강력한 도구이다.

 

 서열 분석

자동화된 DNA 서열 분석은 서열 분석을 매우 일상적인 일과 경제적인 일로 만들었다. 대부분의 실험실에서는 서열 분석 과정을 자신들이 수행하는 것보다 분석해야 할 DNA 시료를 상업적으로 서열 분석을 하는 실험실에 보낸다. 전체 과학계를 위하여 전산화된 서열 데이터베이스들을 모아서 이 정보를 목록으로 만들었다. 목록화된 서열들은 주어진 서열에 대한 DNA, RNA와 단백질의 암호화 부위뿐만 아니라 데이터베이스 내에서 동정을 위한 접속 번호, 발표된 연구의 인용 등을 포함한다. 여러 개의 소프트웨어 프로그램들은 연구자들이 서열을 동정하고, DNA 서열을 잠재적 단백질 암호화 부위로 번역하고, 그리고 서열에 기초한 상동성 또는 유연 관계를 찾기 위해 이 데이터베이스들을 이용하는 것을 허용한다. 환경 미생물학 분야에서 데이터베이스의 가장 흔한 사용은 16S rDNA 서열에 의한 분리균주의 동정과 탐침 또는 PCR 프라이머의 제작을 위한 유전자 서열의 검색과 평가이다.

여러 개의 컴퓨터 소프트웨어 서열분석 프로그램은 서열 검색을 돕는데 이용될 수 있다. 소프트웨어 도구들에는 유전학 컴퓨터

그룹 (Genetics Computer Group, GCG)생명공학 정보를 위한 국립 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 의해 제공되는 FASTA와 BLAST 같은 몇 개의 인터넷 사이트들이 포함된다. 이러한 프로그램들은 연구자들이 관심 있는 핵산 서열의 상동성 또는 특정 부위를 동정할 수 있는 서열 비교를 수행할 수 있게 한다. 연구자들이 데이터베이스에 있는 어떤 서열들이 그들의 미지의 서열들과 유사한지를 밝히거나 공통의 조상을 찾기 위하여 말단의 관계를 동정하기를 원할 때 이 조사 프로그램들이 사용되었다. 예를 들면, 미지의 토양 분리균주로부터의 16S rDNA 서열은 그 생물체의 특성을 밝히고 동정하기 위하여 데이터베이스 내의 다른 서열들과 비교될 수 있다. 추가적으로, 서열들은 PCR 프라이머나 탐침을 제작하기 위하여 평가될 수 있다.

자료은행은 전 세계의 연구원들에 의해 제출된 서열들로부터 만들어졌다. 서열 자료는 특정 서열에 할당된 접근번호, 글로빈 (globin) 같은 특징 양상, “GGTACCTTGAG" 같은 서열 양상, ”lambdga"와 같은 파일 이름, 혹은 다른 알려진 서열의 양상에 대한 조사에 의해 발견될 수 있다. 넓은 범위의 핵산과 단백질 서열 비교를 위하여 다수의 연산 방식이 이용될 수 있다. FASTA와 BLAST는 미동정된 서열들의 현재 자료은행 내에 포함된 것과의 효과적인 비교를 촉진하는 빠른 조사 프로그램이다. 대체방법으로, GCG 프로그램의 일부인 PILEUP는 연속적 쌍방법 정돈 (progressive pairwise alignment)을 이용하여 다중 서열 정렬을 만드는 프로그램이다. GCG는 또한 계통분류도 (phylogenetic tree)를 작성한다.





대전광역시 유성구 문지동 KAIST문지캠퍼스강의동L605호 대표이사:(원장)서범구 사업자번호:314-86-01479
전화번호:1800-0250 팩스번호:07074559748 관리자이메일:puom9@naver.com
이엠생명과학연구원. All Rights Reserved