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효소enzyme 탈수소효소 (dehydrogenase)는 유기화합물의 호흡에 필요한 산화 환원반응을 촉매하는 세포내 효소이다.
2013-08-22 17:32:07
이엠생명과학연구원

탈수소효소 분석

 

탈수소효소 (dehydrogenase)는 유기화합물의 호흡에 필요한 산화 환원반응을 촉매하는 세포내 효소이다. 탈수소효소는 세포 외부에서는 활성이 없기 때문에, 이 분석은 미생물 활성의 측정으로 간주된다. 탈수소효소의 반응은 수용성의 무색에 가까운 테트라졸리움염 (tetrazolium salt)을 사용하여 검출할 수 있는데, 이 시약은 환원될 경우 여러 방식으로 검출이 가능한 붉은색의 포르마잔 (formazan)을 생성한다. 테트라졸리움염은 전자전달계의 환원능에 대해 다른 전자수용체와 경쟁하게 된다. 따라서 테트라졸리움염 환원의 측정이 전자전달계의 활성을 반영한다. 즉, 이러한 측정이 미생물 군집 대부분의 활성의 일반적인 수준에 대한 지표가 되지만, 새로운 생체량의 합성에 의한 미생물 생장의 직접적인 측정은 아니다. 한편 호기성과 혐기성 미생물을 포함하여 모든 호흡하는 생물체는 전자전달계를 가지고 있다는 것을 고려해야 한다. 또한 조류나 진균류와 같은 진핵생물의 개체군도 측정에 포함된다. 따라서 테트라졸리움 환원의 측정은 전자전달계 활성의 전체적인 지표를 제공한다.

널리 사용되는 테트라졸리움염은 INT [2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5- phenyltetrazolium chloride]인데, 진한 색의, 물에 불용성인 포르마잔 (INT-formazan)으로 변환된다. INT는 지표수, 토양과 퇴적토 시료, 지하 퇴적토, 그리고 생물막에서 미생물의 활성을 측정하는 데 사용되고 있다. INT-포르마잔의 생성은 세포 내에 만들어지는 붉은 색 저장물의 현미경 관찰이나 전체 INT-포르마잔 생산의 정량에 의해 검출된다. 현미경 관찰을 통해 전체 세포 수에서 활발하게 호흡하는 세포의 백분율을 결정할 수 있으며, 이는 미생물 개체군의 생리적 상태에 관한 지표를 제공한다. 전체 세포 수는, acridine orange와 같은 모든 세포를 염색하는 대조염색시약을 사용하여 결정할 수 있다. 전체 세포의 수와 INT-포르마잔을 포함하는 세포 수와의 차이가 개체군에서 활발하게 대사하는 부분이 된다. 이것은 매우 민감한 방법이어서, 적은 수의 미생물이 존재하거나 낮은 온도에서 시료를 배양할 경우에도 전자전달계의 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다.

세포의 현미경 관찰에 대한 대안은 생성된 INT-포르마잔의 양을 정량하는 것이다. 일정한 시간동안 환경시료를 INT에 노출시키고, 메탄올과 같은 용매를 사용하여 세포로부터 INT-포르마잔을 추출한다. 추출한 INT-포르마잔은 분광광도계로 검출할 수 있으며, 표준곡선으로부터 전체 생성량을 계산할 수 있다. 전체 INT-포르마잔 생성을 정량함으로써, 이 측정은 서로 다른 시료에서 전자전달계 활성을 비교할 수 있는 상대적인 지표를 제공한다. 하지만 INT는 전자수용체로서는 낮은 효율성을 지니며, 포르마잔 생성은 사용한 INT 농도, 배양시간, 배양온도, 시료의 pH, 그리고 호기성 혹은 혐기성 조건에서의 배양여부 등 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 서로 다른 시료의 직접적인 활성의 비교는 동일한 방법과 실험조건이 사용될 경우에만 실행될 수 있다.

 

 

표. 미생물 활성을 측정하기 위한 일반효소분석법 및 특이효소분석법

효소

기질

분석법의 내용

탈수소효소

트리페닐테트라졸리움

탈수소효소는 염화 트리페닐테트라졸리움을 트리페닐 포르마잔으로 변환한다; 트리페닐포마잔은 메탄올로 추출하여 분광광도법으로 정량한다.

인산가수분해효소

인산 p-니트로페놀

인산가수분해효소는 인산 p-니트로페놀을 p-니트로페놀로 변환하며, 이것을 수용액을 추출하여 분광광도법으로 정량한다.

단백질분해효소

젤라틴

단백질 분해활성의 예로서 젤라틴의 가수분해는 남은 단백질의 양을 구하여 측정한다.

아밀라아제

녹말

남은 녹말의 양은, 요오드와의 반응으로 생성된 청색의 진하기에 의해 분광광도법으로 정량한다.

키티나아제

키틴

환원당의 생성은 anthrone 시약을 사용하여 측정한다.

셀룰라아제

셀룰로오스

카르복시메틸셀룰로오스

환원당의 생성은 anthrone 시약을 사용하여 측정한다. 셀룰라아제는 카르복시메틸셀룰로오스의 점성을 변화시키며, 이를 측정할 수도 있다.

질소고정효소

아세틸렌

질소고정효소는 질소기체 (N2)를 암모니아 (NH3)로 환원시키며, 또한 아세틸렌 (C2H2)을 에틸렌 (C2H4)으로 환원시킬 수 있다; 에틸렌의 생성 속도는 기체 크로마토그래피를 이용하여 측정할 수 있으며, 질소 고정의 속도는 전환인자를 사용하여 계산할 수 있다.

질산염 환원효소

질산염

이화적 질산염 환원효소는 질산염의 소멸 혹은 시료로부터 질소기체와 산화질소와 같은 탈질반응 산물의 발생을 기체 크로마토그래피로 조사하여 분석할 수 있다; 탈질반응은 아세틸렌을 첨가하여 산화질소 단계에서 차단시킬 수 있으며, 이는 분석 과정을 보다 간단하게 한다.

 

 

 에스테라제 분석

환경시료에서 일반적인 혹은 전체 미생물의 활성을 알아보기 위한 또 다른 효소체제는 fluorescein diacetate (FDA)의 가수분해에 기초한 것이다. FDA는 에스테라제 (esterase), 단백질분해효소 (protease), 리파제 (lipase)를 포함한 다양한 효소에 의해서 가수분해된다. FDA의 가수분해 산물은 높은 형광을 나타내는 fluorescein으로, 이 분자는 물에 녹으며 분광광도계나 형광광도계를 이용하여 검출될 수 있다. FDA 가수분해는 토양, 지표하부의 시료, 그리고 하수의 활성슬러지에서 미생물 활성을 조사하는데 사용하고 있다. 결과의 해석은 세심한 주의를 요구하는데, FDA 가수분해에 관여하는 효소가 세포 안 혹은 세포 밖에 존재할 수 있으며, 따라서 그 분석법이 잠재능을 결정하는 것이지 반드시 증식하는 미생물의 활성을 결정하는 것은 아니기 때문이다. 몇몇 연구의 결과는, 미생물 활성 혹은 생체량의 다른 측정방법과 fluorescein 생산과의 상관관계를 보여줌으로써 FDA 사용의 정당성을 어느 정도 확인하고 있다.




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