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효소enzyme 토양효소 Phosphatase 분리방법
2013-08-22 17:33:00
이엠생명과학연구원

토양 내 양분순환은 생화학적, 화학적 물리화학적 반응을 거치는데 생화학적 과정은 미생물, 식물뿌리, 토양식물에 의하여 매개된다. 모든 생화학적 반응은 특이한 활성력과 촉매특성을 갖는 단백질인 효소에 의하여 촉매되며 이 효소는 활성화에너지를 낮추어 빠른 속도로 화학반응을 진행시키는 물질이다. 토양을 세포와 같이 복잡한 생화학적 반응을 갖는 생물체(biological entry)로서 간주할 수 있다. 부식과 무기물의 계로서의 토양은 거대분자의 삼차원적 구조에 의해 안정화된 고정화효소와 차단된 미생물세포를 포함하며 토양내 무기, 유기분획은 효소활성에 지대한 영향을 끼친다. 토양내 효소반응을 조사하고자 할 때는 적절한 효소정량법을 계발하여야 한다. 이는 알고 있는 농도의 기질용액에 일정량의 토양을 가하고 온도, pH, 이온강도 등을 조절한 조건하에서 기질이 생성물로 전환되는 과정을 측정한다.

정량과정을 설계하기 전에 화학양론적으로 매개되는 반응과 기질이외의 필수적인 보인자, 이 보인자에 대한 반응의 동력학적 의존성, 온도, pH, 이온강도의 최적조건, 기질의 분해나 생성물의 출현을 추적하는 적절한 수단이 강구되어야 한다. 현재 토양효소를 연구하는데 가장 큰 난점은 미생물 등 생물체와 관련된 효소적 특성과 세포외 효소의 특성을 구분시키는 일이다. 토양처리는 효소연구에서 얻어진 결과에 지대한 영향을 준다. 특히 장기간 배양하면서 정량할 때에는 미생물의 생육을 방해하거나 극소화하기 위하여 정균제를 사용해야 하지만 효소분석을 행하기 이전에 효소촉매반응에 대한 정균제의 영향을 계산하여야 한다.

고에너지 조사멸균법이나 항생물질사용이 고려되었으나 이들도 정균제사용법과 같이 효소반응속도를 바꾼다. 비록 토양으로부터 효소유출에 대한 보고는 있었으나 미생물, 식물, 동물조직에서 추출된 효소만큼은 순수하게 정제할 수 없다. 그러므로 토양효소에 대한 대부분의 평가는 효소의 정제보다는 토양시료에서 효소촉매반응속도를 측정하는 것이다. 수 많은 토양내 효소촉매반응이 평가되었으나 그 중 특히 일부의 정량법만이 표준 분석법으로 인정 받고 있다. 그러므로 본 편에서는 토양에서 활성이 있다고 알려진50 여종의 효소에 대하여 모두 언급하기 보다는 C, N, P, S순환에 관여하는 중요한 효소에 대하여 정량법을 논하고자 한다.

 

1. Phosphatase

 

인산가수분해효소(phosphotase)는 인산의 에스터와 무수물의 가수분해를 촉매하는 효소이다.이는 phosphoric monoester hydrolase(EC), phosphoric diester hydrolase(EC ), triphosphoric monoester hydrolase(EC 3.1.5), phosphoryl기 함유 유기물에 작용하는 효소(EC), P - N결합에 작용하는 효소(EC)로 대별된다. 토양유기능인산의 무기화와 식물영양상의 중요성 때문에 phosphomonoesterase는 널리 연구되었으며 이 효소는 acid phosphatase(EC)와 alkaline phosphatase(EC)로 구성된다. 이들 중에서 연구문헌의 대부분은 acid phosphatase에 집약되어 있다.phosphomonoesterase가 촉매하는 반응은 다음과 같다.

acid phosphatase는 산성 토양에, alkaline phosphatase는 알칼리성 토양에 널리 존재한다.

Phosphodiesterase(EC)는 토양내 phosphatase 중에서 연구가 가장 미진하다.

이 효소가 촉매하는 반응은 다음과 같다.

R1과 R2는 alcohol기나 phenol기 또는 nucleoside이다.

Inorganic pyrophosphatase(EC)는 pyrophosphate를 orthophosphate로 가수분해하며 이 반응은 다음과 같다.

 

기질인 pyrophosphate가 비료로 쓰이므로 토양 내 이 효소의 활성은 특별한 주목을 받아왔다.

 

1.1 원 리

phosphomonoesterase 활성정량과정은 토양에 완충된 sodium-p-nitrophenol phosphate용액과 toluene을 가하고 방출된p-nitrophenol의 양을 비색정량하는 것이다. P-nitrophenol의 비색정량은p-nitrophenol의 알칼리 용액이 황색을 띠는 점에 근거한다. P-nitrophenol추출을 위한 CaCl2 - NaOH처리는 phosphatase활성을 정지시키고 p-nitrophenol의 황색을 발색시키며 토양으로부터 p-nitrophenol을 정량적으로 회수하기 위한 것이다.

Phosphodiesterase 정량원칙은 기질인 bis-p-nitrophenylphosphate(BPNP)가 NaOH용액에서 불안정하므로 방출된p-nitrophenol을 추출하기 위하여 0.1M THAM완충용액(pH 12)을 사용한다.

Inorganic pyrophosphatase 활성정량은 토양을 완충된 pyrophosphate용액(pH 8.0)에 배양할 때 방출된 orthophosphate의 측정에 기초한다. pyrophosphate의 효소적 가수분해에 의해 방출된 orthophosphate의 측정에는3 가지 난점이 내재되어 있다. 이는 (I) 방출된 orthophosphate가 토양성분에 흡착되어 유출되지 않는 것 (ii) 효소 이외의 낮은 pH 등의 요인에 의하여 기질(pyrophosphate)로부터 계속적으로 orthophosphate로 가수분해되는 것 (iii) pyrophosphate의 존재가 orthophosphate의 측정을 방해하는 것이다.

1N H2SO4용액을 써서 orthophosphate를 추출하면 토양에 가해진 orthophosphate를 정량적으로 회수할 수 있다. pyrophosphate존재조건하에서 추출된 orthophosphate의 비색법은 orthophosphate에 대해 특이성을 갖는다. 이 방법은 ascorbic acid - trichloroacetic acid시약 존재하에서 orthophosphate가 molybdate이온과의 반응에 의해 청색이 급속히 형성되게 하는 과정과 기질 pyrophosphate의 가수분해로쿠터 생긴 orthophosphate에서 유래된 청색의 형성을 막기 위해 citrate-arsenite 시약에 의한 과염의 molybdate의 복합체과정을 포함한다.

 

1.2 활성측정법

  1.2.1 Phosphomonoeeaterase(PME)

1. 기구

1) 배양 flask ,50㎖ 삼각flask와 고무마개

2) 항온기

3) 분광광도계

    2. 시약

1) toluene, 특급시약

2) MUB완충용액원액

12.1g의 tris(hydroxymethyl) aminomethane(THAM), 11.6g의 maleic acid, 14.0g의 citric acid, 9.3g의 붕산(H3BO3)을 488㎖1N NaOH 용액에 용해하고 증류수로1ℓ로 만들어서 냉장고에 보관한다.

3) MUB완충용액(pH 6.5)

200㎖의MUB완충용액원액을 500㎖beaker에 붓고 자석교반기 위에 놓는다. 0.1N HCl용액을 사용하여 pH 6.5로 조절하고 증류수로1ℓ표선을 맞춘다.

4) p-nitrophenyl phosphate용액(PNP) 0.025M

0.420g의 disodium p-nitrophenyl phosphate.4H2O을 50㎖의volumetric flask에 취하고 MUB완충용액에 녹여서50㎖로 만들어 냉장고에 보관한다.

5) 염화칼슘(CaCl2)용액. 0.5M

73.5g의 CaCl2.2H2O를 증류수에 용해하여1ℓ로 한다.

6) 수산화나트륨(NaOH)용액0.5M

20g의 NaOH를 증류수에 용해하여1ℓ로 한다.

7) p-mitrophenol

1g의 p-mitrophenol(C6H6.NO3)을 증류수에 녹이고1ℓ로 만들어 냉장고에 보관한다.

    3. 조작과정

1g의 토양( < 2㎜)을 50㎖의 삼각 플라스크에 취하고 0.2㎖의 toluene, 4㎖의 MUB완충용액(pH 6.5), 1㎖의 p-nitrophenyl phosphate용액을 가한다. 수 시간 플라스크를 흔들어서 내용물을 혼합한다. flask에 마개를 닫고 37℃의 항온조에서 1시간 배양한다. 1시간 후 마개를 제거하고 1㎖의 0.5M CaCl2용액과 4㎖의 0.5M NaOH용액을 가한다. 수 초간 플라스크를 흔들고 토양현탁액을 Whatman No.2여지로 거른다. 이 여액의 흡광도를 400㎚에서 측정한다. 0, 10, 20, 30, 40, 50㎍의 p-nitrophenol을 함유하는 표준용액을 써서 얻은 검량선을 대조로 하여 여액 중의 p-nitrophenol함량을 계산한다. 이 검량선을 그리기 위해서는 p-nitrophenol 표준용액 1㎖를 취하고 증류수로 100㎖로 만든다. 이 희석된 표준용액을 0, 1, 2, 3, 4, 5㎖를 취하고 증류수로 최종 농도가 5㎖가 되도록 조절한다. 1㎖의 0.5M CaCl2 용액과 4㎖의 0.5M NaOH 용액을 가하고 잘 흔든 뒤 Whatman NO.2여지로 거른다. 이 용액의 흡광도를 400㎚에서 측정한다. 여액의 흡광도가 50㎍의 p-nitrophenol 표준액의 흡광도보다 높으면 측정치가 검량선 안에 들 수 있도록 증류수로 희석해야 한다.

Phosphatase 활성에 의한 p-nitrophenol로 부터 유래되지 않은 색을 분석하기 위해 각 토양에 대하여 공 실험을 행해야 한다. 공 실험은 앞의 과정과 동일하나 1㎖의 0.5M CaCl2용액과 4㎖의 0.5M NaOH를 가한 후 토양현탁액을 여과하기 직전에 1㎖의 PNP용액을 가한다.

  1.2.2 Phosphodierterase(PDE)

   

1. 기구

  PME참고편

    2. 시약

1) toluene,특급시약

2) THAM 완충용액, 0.05M, pH 8.0

6.1g의 THAM을 약 800㎖의 증류수에 용해하고 0.2N H2SO4용액을 사용하여 pH 8.0으로 조절하고 증류수로 1ℓ를 만든다.

3) Bis-p-nitrophenyl phosphate(BPNP)용액, 0.005M

0.1811g의 sodium bis-p-nitrophenyl phosphate를 THAM완충용액에 녹여 100㎖로 만들어 냉장고에 보존한다.

4) 염화칼슘용액, 0.5M

PME참고편

5) THAM - NaOH 추출용액, 0.1M, pH 12

12.2g의 THAM을 800㎖의 증류수에 용해하고 0.5M NaOH로 적정하여 pH 12로 조절한 후 증류수로 1ℓ를 만든다.

6) THAM 희석액, 0.1M, pH 약 10

12.2g의 THAM을 증류수에 용해하여 1ℓ를 만든다.

7) p-nitrophenol 표준용액

    3. 조작 과정

1g의 토양( < 2mm)을 50㎖ 삼각플라스크에 취하고 0.2㎖의 toluene, 4㎖의 THAM(pH 8.0)을 가한다. 수 초간 흔들어서 내용물을 혼합한다. 플라스크에 마개를 하고 37℃에서 배양한다. 1시간 후 마개를 제거하고1㎖의0.5M CaCl2용액과 4㎖의 THAM ? NaOH 추출용액을 가하고 수 초간 플라스크를 흔든다. 토양현탁액을 Whatman NO. 2여지로 여과한다. 황색의 여액의 흡광도를 400㎚에서 분광광도계로 계산한다.

PEM의 검량선을 대조로 하여 p-niyrophenol 함량을 계산한다. 여액의 흡광도가 50㎍p-niyrophenol의 흡광도보다 높으면 흡광도 측정치가 검량선의 범위 내에 들도록 일정량의 여액을 0.1M THAM희석액(pH 약10)으로 희석한 후 측정한다. PDE활성에 의한 p-nitrophenol로부터 유출되지 않은 색을 분석하기 위하여 각 토양에 대하여 공 실험을 행해야 한다. 공 실험은 PDE의 분석과정을 따르나 0.5M CaCl2용액과 4㎖ 0.1M THAM - NaOH추출액을 가한 후 토양현탁액을 여과하기 직전에 1㎖ BPNP용액을 가한다.

  1.2.3 Inorganic Pyrophosphatase

    1. 기구

1) 원심분리관, 50㎖의 플라스틱 제품

2) 항온기

3) 왕복진탕기

4) 원심분리기, 12000rpm의 고속

5) 분광광도계

    2. 시약

1) 수산화나트륨(NaOH), 1N

2) MUB 완충용액원액

PME 편 2번 시약 참조

3) MUB 완충용액, pH 8.0

200㎖의 MUB 완충용액원액을 0.1N HCl을 사용하여 pH 8.0으로 조절하고 증류수로 1ℓ를 만든다.

4) pyrophosphate 용액, 50mM

2.23g의 Na4P2O7.10H2O을 20㎖의 MUB 완충용액원액에 녹이고 0.1N HCl용액으로 pH 8.0으로 조절한다. 증류수로 100㎖로 만든다. 이 시약은 당일 조제해야 한다.

5) 황산 용액, 1N

250㎖ conc.H2SO4를 8ℓ 증류수에 가하고 증류수로 9ℓ로 만든다.

6) A 시약 : ascorbic acid(0.1M) - trichloroacetic acid(0.5M)

8.8g의 ascorbic acid와 41g의 trichloroacetic acid를 약 400㎖의 증류수에 용해하고 증류수로 500㎖ 표선을 맞춘다. 이 시약은 당일 조제하여야 한다.

7) B 시약 : ammonium molybdate 시약, 0.015M

9.3g의 ammonium molybdate[(NH4)2Mo7O24.4H2O]를 약 450㎖ 증류수에 녹이고 증류수로 500㎖로 만든다.

8) C 시약 : sodium citrate(0.15M) - sodium arsenite(0.3M) - CH3COOH(7.5%) 시약

44.1g의 sodium citrate와 39g의 sodium arsenite를 800㎖의 증류수에 용해한다. 75㎖의 빙초산(99.9%)을 가하고 증류수로 1ℓ로 만든다.

9) 인산염완충용액

0.4390g의 인산일칼륨(KH2PO4)을 증류수에 용해하여1ℓ로 만든다.

이 용액은 100㎍PO43-P/㎖를 함유한다.

    3.조작과정

1g의 토양( < 2mm)을 50㎖ 플라스크제 원심분리관에 취하고 3㎖의 50mM pyrophosphate용액을 가한다. 수 초간 원심분리관을 흔들어서 내용물을 혼합한다. 마개를 닫고 37℃에서 배양한다. 5시간 후 마개를 제거하고 바로 3㎖의 MUB용액(pH 8.0)과 25㎖ 1N H2SO4 용액을 가한다. 마개를 막고 수평으로 눕혀 왕복진탕기에서 3분간 교반한다. 토양현탁액을 12,000 rpm에서 30초간 원심분리하고 PO43-P 분석을 위해 즉시 상등액의 일부분을 취한다.

Inorganic Pyrophosphatase에 의해 추출된 Pi를 분석하기 위해서는 25㎖ volumetric flask에 10㎖의 A 시약을 가한 후 상등액 1㎖를 넣는다. 즉시 2㎖의 B 시약과 C 시약을 가한다. 시료액과 B시약, C시약을 넣을 때마다 flask를 흔든다. 증류수로 25㎖로 만들고 15분 후 700nm에서 청색의 흡광도를 측정한다. 0, 5, 10, 15, 20, 25㎍ PO43-P를 함유한 표준액으로 작성한 검량선에 따라 PO43-P 함량을 계산한다. 이 검량선을 작성하기 위해서는 PO43-P 표준액을 100㎖ volumetric flask에 0, 5, 10, 15, 20 ,25㎖를 취하고 증류수로 표선을 맞춘다. 잘 흔들어 내용물을 혼합한다. 이 희석된 표준용액을 1㎖씩 취하여 앞에 기술한 PO43-P 분석법에 의하여 분석한다.

Pyrophosphatase 활성에 의한 Pyrophosphate에서 유출되지 않은 PO43-P를 정량하기 위해여 각 토양시료에 대하여 공시험을 행해야 한다.

- 주의 -

PME와 PDE의 정량에 쓰이는 기초용액은 냉장고에 보존하면 수 일간 안정하다. 기질은 데시케이터에 넣어 냉동실에 저장한다. PME 정량 시 NaOH처리에 따른 점토의 분산과 토양유기물의 추출을 막기 위하여 CaCl2를 가한다(점토의 분산은 여과를 어렵게 하고 NaOH에 의한 암색의 유기물은 p-nitrophenol의 비색정량을 방해한다.).

Pyrophosphatase 활성정량 시에는 Pyrophosphate가 추출액인 1N H2SO4 존재하에서 시간이 지남에 따라 서서히 가수 분해되므로 Pyrophosphatase에 의해 추출되는 orthophosphate의 정량은 추출 후 즉시 진행하여야 한다. 




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