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효소enzyme urease(urea aminohydrolase, E.C )는 요소를 CO2와 NH3로 가수분해촉매하는 효소이다.
2013-08-22 17:34:01
이엠생명과학연구원

Urease

urease(urea aminohydrolase, E.C )는 요소를 CO2와 NH3로 가수분해촉매하는 효소이다.

NH2CONH2 + H2O → CO2 + 2NH3

2단계의 반응에서 carbamate는 중간대사체이다. carbamate는 제 2단계의 필수적인 기질이다.

 

Urease는 자연계에 널리 존재하며 미생물, 식물, 동물에서 발견되며 토양내의 urease활성은 1935년 Rotini에 의해 최초로 밝혀졌다. urease는 1926년 summer가 결정화한 최초의 효소단백질이고 반응생성물(CO2와 NH3)을 정량하기 용이하며 비교적 저렴한 가격으로 구입이 가능한 점으로 널리 평가되었다. 토양 urease의 활성은 pH 8.5∼9.0의 THAM완충용액에서 최적이다.

 

1. 원리

Urease에 의해 생성된 ammonia량을 정량하는 방법은 토양에 THAM완충용액, 요소용액, toluene을 가하고 37℃에서 2시간동안 배양할 때 urease에 의해 방출된 NH4+를 정량하는 것이다. 배양 후 urease의 활성을 정지시키기 위하여 Ag2SO4가 함유된 2M KCl용액을 처리하고 토양현탁액의 일정량을 MgO를 가하여 수증기증류한다. 이 방법에서는 urease를 최적 pH 9.0과 0.02M 농도의 기질에서 정량한다. 한편 기질인 요소의 감소를 정량하는 방법은 요소의 가수분해과정을 측정하기 위한 것이다. 토양을 요소용액과 함께 37℃에서 5시간 동안 배양 후 잔존하는 요소량을 비색정량한다. 5시간 동안 토양 g당 가수분해된 요소량은 가한 요소의 최초량과 배양 후 회수된 요소량과의 차이에서 추정한다.

2. 활성측정법

 

2.1 방출된 NH4+-N의 정량

 

    1. 기구

1) Volumateric flask, 50㎖

2) 항온기

3) 증류장치

    2. 시약

1) toluene

2) THAm완충용액, 0.05M, pH 9.0

6.1g의 THAM으로 약 700㎖의 증류수에 녹이고 0.2M의 H2SO4용액을 사용하여 pH 9.0으로 조절하고 증류수로 1ℓ 만든다.

3) 요소용액, 0.2M

1.2g의 요소를 THAM완충용액에 녹여서 100㎖로 한다. 이 용액을 냉장고에 보관한다.

4) 2.5M KCl - 100ppm Ag2SO4용액

100㎎의 Ag2SO4를 700㎖의 증류수에 용해하고 이 용액에 188g의 KCl을 녹인다. 증류수로 1ℓ 만든다.

5) NH4+-N 정량용시약

① 산화 마그네슘(MgO)

MgO를 600∼700℃의 전기로에서 2시간동안 가열한다. KOH pellet이 담긴 데시케이터에 식힌 후 병에 넣고 단단히 마개를 막아 보관한다.

② 붕산 - 지시약 시약

20g의 순수한 붕산(H3BO3)을 700㎖의 뜨거운 물에 녹이고 이를 식혀서 200㎖의 에틸알콜과 20㎖의 혼합지시약용액(0.3g의 bromocresol green과 0.165g의 methyl red를 500㎖의 ethanol에 녹인 것)이 담겨진 1ℓ의 volumetric flask에 넣는다. 이 flask의 내용물을 잘 혼합한다. 이 용액 1㎖에 증류수 1㎖를 가할 때 용액의 색이 연분홍에서 청자색으로 변화할 때까지 0.05N 수산화나트륨액을 가한다. 이것에 증류수를 가하여 전 량을 1ℓ로 한다.

③ 0.005N H2SO4용액

    3. 조작과정

5g의 토양( < 2㎜)을 50㎖ voulmetric flask에 넣고 0.2㎖의 toluene과 9㎖의 THAM완충용액을 가한다. 수 초간 flask를 흔들어 내용물을 혼합한다. 1㎖의 0.2M 붕소용액을 가하고 수 초간 flask를 흔든다. flask에 마개를 막고 37℃의 항온기에 넣는다. 2시간 후 마개를 제거하고 약 35㎖의 KCl-Ag2SO4용액을 가하고 수 초간 flask를 흔든다. 내용물이 실온으로 식을 때까지 약 5분간 플라스크를 방치한다. KCl-Ag2SO4용액으로 용량을 맞추고 플라스크를 몇 차례 뒤집어서 내용물을 혼합한다. 토양현탁액에서 NH4+-N을 정량하기 위하여 현탁액 20㎖를 100㎖ 증류flask에 취한다.

2g의 MgO를 가하고 수증기 증류하여 방출된 NH4+-N을 정량한다. urease활성을 통한 붕소로부터 유래되지 않은 NH4+-N을 정량하기 위하여 공 실험을 행해야 한다. 공 실험은 urease 정량과정에 준하되 35㎖의 KCl-Ag2SO4용액을 가한 후 1㎖의 0.2M 붕소용액을 가한다.

  2.2 잔존 붕소의 정량

    1. 기구

1) Volumetric flask, 50㎖

2) 항온기

3) 비등수조

4) 흡인 깔대기(polyethylene제)와 여과 깔대기 스탠드

5) 분광광도계

    2. 시약

1) 요소용액

2.0g의 요소를 증류수에 녹여 1ℓ로 만든다. 이 용액은 ㎖ 당 2㎍의 요소를 함유한다.

이 용액은 냉장고에 보존한다.

2) PMA용액

50㎎의 phenylmercuric acetate를 증류수에 녹여서 1ℓ로 만든다.

3) 2M-KCl-PMA용액

1,500g의 KCl을 증류수에 녹여 9ℓ로 만들고 1ℓ의 PMA를 가한다.

4) diacethylmonoxime(DMA용액)

2.5g의 dam을 증류수에 녹이고 100㎖로 만든다.

5) thiosemicarbazide(TSC용액)

0.25g의 TSC를 증류수에 녹이고 100㎖로 만든다.

6) Acid reagent

100㎖의 증류수에 300㎖의 85% 인산(H3PO4)과 10㎖의 conc.H2SO4를 가하고 증류수로 500㎖를 만든다.

7) 발색시약(color reagent)

사용하기 직전에 500㎖의 acid reagent에 25㎖의 DAM용액과 10㎖의 TSC용액을 가하여 조제한다.

8) 검량선 작성용 붕소표준액 원액

0.500g의 요소를 1,500㎖의 2M KCl - PMA용액에 용해하고 같은 용액으로서 2ℓ로 표선을 맞춘다. 순수한 건조요소를 사용하면 이 용액은 ㎖ 당 250㎍의 요소를 함유한다. 이 용액은 냉장고에 보존한다.

    3. 조작과정

5g의 토양( 2㎜, 오븐건조토양을 기준하여)을 100㎖의 삼각플라스크에 취하고 5㎖의 요소용액(10㎎의 요소)을 처리한다. flask에 마개를 하고 37℃에서 배양한다. 5시간 후 마개를 제거하고 50㎖의 2M KCl-PMA용액을 가한다.

원래 가한 요소의 ㎍ 수인 2,000에서 이 값을 제해야 한다. 즉,

- 주 의 -

방출된 NH4+의 정량에 의한 분석법에서는 인산염완충용액 등 다른 완충용액을 사용하면 토양 urease의 활성이 저하되므로 꼭 THAM완충용액을 사용해야 한다. Ag2SO4가 KCl용액에서 잘 녹지 않으므로 제시한 순서대로 Ag2SO4 용액에 KCl을 가해서 조제해야 한다. KCl- Ag2SO4 처리는 urease 활성을 정지시키기 위해 쓰이며 토양현탁액을 2시간 이내에 NH4+를 분석한다면 부가적인 NH4+의 추출은 없다. 그러나 KCl- Ag2SO4시약을 가한 후 4시간이내에 토양현탁액을 분석할 수 없으면 flask를 냉장고에 보존하여야 한다. 한편 잔존요소의 정량에 의한 분석법에서 500∼550nm의 흡광도를 측정할 수 있는 비색계나 분광광도계를 사용할 수 있다. 요소와 DAM, TSC의 반응에서 최대 흡광도를 보이는 파장은 527nm이다, 또 끓는 물이 담긴 수조대신에 120℃로 조절한 오븐을 쓸 수 있는데 최대 발색에 소요되는 시간은 30분으로 단축시킬 수 있다. 요소표준액으로 작성한 검량선에서 요소농도와 흡광도간에는 직선의 상관선을 보이나 할 때마다 약간의 차이를 보일 수 있으므로 분석할 때마다 요소표준액을 포함시켜야 한다.

추출액의 NO2- - N농도가 요소태질소농도보다 5배이상 높다면 NO2는 요소의 비색정량법을 방해한다. 이렇게 높은 농도의 NO2- - N이 토양이나 요소처리토양 중에 존재하리라고 생각되지는 않으나 요소분석을 위해 취한 일정량의 추출액에 1㎖의 2%(W/V) sulfamic acid를 가하고 5분간 놓아 둔 후 발색시약을 가하면 NO2의 간섭을 줄일 수 있다. 발색시약은 불안정하므로 사용하기 직전에 조제해야 한다.

다른 시약들은 냉장고에 보존하면 수 주간 안정하다.




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