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효소enzyme 유기화합물의 생화학적 산화는 일반적으로 탈수소화과정이며 탈수소효소(Dehydrogenase)가 특이적으로 작용한다.
2013-08-22 17:34:56
이엠생명과학연구원

Dehydrogenase

 

유기화합물의 생화학적 산화는 일반적으로 탈수소화과정이며 탈수소효소(Dehydrogenase)가 특이적으로 작용한다. 탈수소화작용의 전체과정은 다음과 같다.

XH2 + A → X - AH2 

 

XH2는 유기화합물(수소공여체)이고 A는 수소수용체이다

탈수소효소는 기질에서 수용체로 수소를 전이하므로 토양유기물의 중요한 역할을 한다. 토양탈수소효소의 활성에 관여하는 수 많은 다른 특이한 탈수소효소계들은 미생물의 필수적인 부분이다. 따라서 탈수소효소활성의 정량은 활동적인 개체군의 평균활동의 결과라 할 수 있다.

 

1.1 원리

Tetrazolium염은 4급 NH4+염으로 수용성이 대단히 높다. 무색 또는 연한 색의 Tetrazolium염은 환원에 의해 적색의 methanol에 녹는 formazan으로 쉽게 변환된다. TTC(2,3,5 - tri phenyltetrazolium)의 겉보기 산화환원전위가 ?0.08V이므로 TTC가 많은 탈수소효소의 전자수용체로 작용하게 된다. 본 분석법은 TTC의 환원에 따라 생성된 TPF(triphenyl formazan)을 methanol로 추출하여 비색정량하는 것이다. 이 변형은 환상구조의 파괴에 의해 일어나고 일부 반응과정은 그림과 같다.

2.1 활성측정법

 

  2.1. 1. 기구

1) 시험관, 직경 16mm × 길이 150mm

2) 항온기

3) 분광광도계

 

  2.1.2 시약

1) 탄산칼슘, 특급시약

2) 2,3,5 - triphenyltetrazolium chloride(TTC)용액, 3%

3g의 TTC를 증류수에 녹여 100㎖로 만든다.

3) Methanol(CH3OH)

4) triphenyl formazan(TPF)표준용액

100㎎의 TPF를 methanol에 녹여 100㎖로 만들어 철저히 혼합한다.

2.1.3. 조작과정

20g의 풍건토( < 2mm )와 CaCO3를 완전히 섞고 이들 혼합시료 6g씩을 각각 3개의 시험관에 취한다. 각 시험관에 1㎖의 TTC용액(3%)과 2.5㎖의 증류수를 가한다. 이 액체의 양은 혼합한 후 토양표면에 소량의 유동수가 나타나기에 충분해야 한다. 각 시험관의 내용물을 유리막대로 혼합하여 마개를 막고 37℃에서 배양한다. 24시간 후 마개를 제거하고 10㎖의 methanol을 가한다. 다시 시험관에 마개를 막고 1분간 흔든다. 100㎖의 volumetric flask에 탈지면으로 막은 유리깔대기를 놓고 토양현탁액을 여과시킨다. methanol로 시험관을 세척하고 정량적으로 토양을 깔대기에 옮긴다. 솜마개로부터 빨간 색이 없어질 때까지 10㎖씩 methanol을 가한다. 여액에 methanol을 가하여 100㎖로 만든다. methanol을 blank로 하여 485nm에서 적색의 흡광도를 측정한다. TPF표준용액으로 작성한 검량선을 대조로 생성된 TPF의 양을 계산한다. 검량선을 작성하기 위하여 10㎖의 TPF표준용액을 methanol로 100㎖로 희석한다(100㎍ TPF/㎖). 이 용액 5, 10, 15, 20 ㎖를 100㎖ volumetric flask에 취하여(500, 1,000, 1,500, 2,000 ㎍ TPF/100 ㎖) methanol로 표선을 맞추고 충분히 혼합한다. 적색의 TPF의 흡광도를 485nm에서 측정하여 검량선을 작성한다.

- 주의 -

일반적으로 Tetrazolium염은 빛에 대한 혹애성이 높으며 가시광선을 쪼이면 노란색으로 변한다. 생성된 TPF도 빛에 대한 혹애성이 높아서 가시광선에 장기간 노출되면 TPF는 적색에서 황색으로 변한다. 황색으로 된 것을 어두운 곳에 놓아두면 점진적으로 적색으로 된다. 이 현상은 cis-trans이성화작용에 의한 것이다. 생성된 TPF를 토양으로부터 정량적으로 추출하는 일이 중요한 데 이는 깔대기에 담긴 토양시료에 methanol을 조금씩 가하면서 세척하면 가능하다. 또 여액이 흐리면 실제의 탈수소효소활성보다 높은 값을 보이므로 methanol추출액의 혼탁(tubidity)을 막도록 주의해야 한다.




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