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효소enzyme 토양 중의 단백질은 동식물이나 미생물에 의해 공합되어 protease에 의해 분해된다.
2013-08-22 17:35:48
이엠생명과학연구원

Protease

 

토양 중의 단백질은 동식물이나 미생물에 의해 공합되어 protease에 의해 분해된다. 토양의 protease는 1910년 Fermi에 의해 최초로 발견되었다. 토양에 존재하는 protease는 토양에 집적한 유리효소로서 이 효소를 토양으로부터 유출하여 가용화시키면 활성이 높아지며 또 토양으로부터 유출가능한 protease는 미생물에 의하여 쉽게 분해되나 유출되지 않은 protease는 토양콜로이드와 복합체를 형성하여 미생물에 분해되기 어려워 안정하다.

protease에 의해 단백질이 아미노산으로 가수분해되는 반응은 토양비옥도에서 필수적인 역할을 하는 질소순환의 중요한 과정 중의 하나이다.

 

 

1. 원리

protase는 단백질이 펩티드 결합의 가수분해를 촉매한다. 측정법은 토양에 ovalbumin , caseine 등을 가하고 생성된 유리아미노산의 정량에 의해 측정하였으나 최근에는 합성기질을 써서 급속하게 정량할 수 있게 되었다.

여기에서는 합성 dipeptide인 N-carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-Leucine(CBZ-phe-leu)을 기질로 써서 반응에 따라 생긴 아미노산을 ninhydrine법으로 발색시켜 비색정량하는 방법에 대하여 서술한다. 그 전 반응과정은 다음과 같다.

 

 

2. 활성측정법

   2.1 기구

1) 삼각플라스크(50㎖)와 중형시험관

2) 진탕항온기

3) 비등수조

4) 분광광도계

   2.2 시약

1) toluene

2) THAM - HCl완충용액, 0.1M, pH 8.1

0.2M THAN용액 250㎖와0.1N 225㎖ 및 증류수 25㎖를 혼합한다.

3) 초산원형용액, 4M, pH 5.51

544g의 초산나트륨을 약 400㎖의 증류수에 녹인다. 이것에 빙초산 100㎖와 증류수 400㎖를 가하고 NaOH용액으로 pH를 조절하고 증류수로1ℓ를 만든다.

4) N-carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-leucine(N-CBZ-phe-leu)용액, 1mM

41.25㎎의 N-CBZ-phe-leu(sigma사 제품, 무수화물)을 100㎖ volumetric flask에 취하고 0.1M의 pH 8.1 THAM - HCl완충용액으로 표선을 맞춘다. 냉장고에 보존한다.

5) ninhydrin용액

5g의 ninhydrin과 0.75g의 hydrindantin을 188㎖의 2-methoxyethanol에 녹인 후 63㎖의 초산완충용액을 가하고 곧바로 갈색병에 담아 밀봉보존한다.

6) ethanol : H2O혼액(1:1, V/V)

7) leucine 표준용액, 10-4M

131.71㎎의 leucine을 100㎖ volumetric flask에 취하고 증류수로 녹여 표선을 맞춘다. 이 용액 1㎖를 취하여 증류수로 100배 희석한다. 이 용액은 냉장고에 보존한다.

8) HCl용액, 5N

  2.3 조작과정

0.5g의 토양시료( < 2㎜)를 50㎖의 삼각플라스크에 취하고 0.1㎖의 톨루엔을 가한다. 이어서 3.0㎖의 N-CBZ-phe-leu기질용액을 가하고 30℃에서 2시간 진탕배양한 뒤 0.2㎖의 5N HCl을 가하여 반응을 정지시킨다. 5분간 더 진탕하고 증류수를 6.8㎖ 가하여 Toyo No. 131 여자로 거른다. 여액 2㎖에 ninhydrin 시약 1.0㎖를 가하고 알루미늄 호일로 마개하고 끓는 물에 15분간 가열한다. 가열종료 후 5분간 흐르는 물에 담가 식힌 후 에탄올 : H2O혼액 3.0㎖씩을 가하여 희석한다(색이 진할 때는 6∼8㎖를 가하여도 좋다.). 충분히 흔든 후 분광광도계로 570㎚에서 흡광도를 측정한다. 콘트롤을 뺀 △A570을 검량선에 대입하여 아미노산을 정량한다. 검량선을 작성하기 위해서는 leucine 표준용액을 0.5, 1.0, 1.5, 2.0㎖ 취하고 각기 증류수로 2㎖가 되도록 채우고 1㎖의 ninhydrin 시약을 가한다. 나머지는 상기의 과정에 준하여 행한다.




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