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효소enzyme glutaminase(glutamine amidohydrolase)는 glutamine의 amid-N의 가수분해에 영향을 주며 토양 내 가수분해 받기 쉬운 형태의 질소의 가용화에
2013-08-22 17:36:29
이엠생명과학연구원

Glutaminase

glutaminase(glutamine amidohydrolase)는 glutamine의 amid-N의 가수분해에 영향을 주며 토양 내 가수분해 받기 쉬운 형태의 질소의 가용화에 기여한다. 토양의 아미노산으로부터 NH3를 생성하는 반응은 작물생산 상 대단히 중요하다.

 

1.원리

토양에 glutamine을 가한 후 생성된 NH3의 정량에 의해 측정하며 반응은 다음과 같다.

 

 

2. 활성화측정

 2.1. 기구

1) 중형시험관(직경 18 × 길이 180mm)

2) 수조

3) 분광광도계

  2.2. 시약

1) 톨루엔

2) 인산buffer(0.1M, pH 7.6 )

1ℓ의 volumetric flask에 0.1M의 인산1칼륨용액(KH2PO4) 500㎖와 0.1N NaOH용액 428㎖를 가하고 증류수로 1ℓ를 만든다.

3) L-glutamine용액(0.25M)

3.66g의 L-glutamine을 100㎖의 volumetric flask에 취하고 0.1M의 인산완충용액(pH 7.0)에 녹인다.

4) Nessler의 시약

5g의 KI를 5㎖의 증류수에 녹이고 미세한 침전이 생길 때까지 25%의 HgCl2(W/V)를 한방울씩 가한다. 이어서 45㎖의 50% KOH용액(W/V)을 가하고 증류수로 100㎖로 만든다.

5) 0.5M KCl - 0.15M NaOH용액

37.28g의 KCl과 6.0g의 NaOH를 증류수에 녹여 1ℓ로 만든다.

6) 5M HCl용액

HCl(35%, s.g 1.17) 89.1㎖를 증류수에 희석하여 200㎖로 만든다.

  2.3. 조작과정

습윤토 1.0g( < 2mm )을 중형시험관에 취하고 0.2㎖의 톨루엔과 5.0㎖의 L-glutamine용액(0.25M)을 가한다. Vortex mixer로 10∼15초간 내용물을 혼합한다. 시험관을 30℃의 수조에 2∼5시간 놓아둔다. 배양 후 0.3㎖의 HCl용액(5M)을 가하고 5분간 놓아둔다. 그리고 9.7㎖의 0.5M KCl - 0.15M NaOH용액을 가한다. 토양현탁액으로부터 NH4+를 추출하기 위하여 15초간 vortex mixer로 진탕하고 Toyo No.131 여지를 써서 여과한다. 적당량의 여액(0.1∼0.3㎖)을 증류수(3.6∼3.8㎖)로 희석한다. 희석액 1㎖에 1.0㎖의 0.1M 인산완충용액과 0.1㎖의 Nessler시약을 가하고 3분 후 436nm에서의 흡광도를 측정한다. 대조로서 토양을 가하지 않은 것과 기질을 가하지 않은 것에 대하여도 같이 조작하여 이들의 값을 뺀 것을 glutaminase활성으로 한다. 효소활성은 30℃에서 1분간 건토 g당 n mole의 NH4+ 의 량을 mu로 표시한다. 검량선은 0∼2.0 μ mole NH4+을 함유하는 표준용액으로 같이 조작하여 작성한다. 




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