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효소enzyme 미생물의 공중질소고정효소(nitrogenase)가 아세틸렌(C2H2)을 에틸렌(C2H4)으로 환원하는 작용
2013-08-22 17:37:09
이엠생명과학연구원

Dilworth 등이 처음으로 미생물의 공중질소고정효소(nitrogenase)가 아세틸렌(C2H2)을 에틸렌(C2H4)으로 환원하는 작용이 있다는 것을 발표가 이래, 종래의 Kjeldahl법이나 중질소법보다 감도가 높은 아세틸렌 환원법으로 공중질소고정에 대한 연구를 진행하고 있다. 이 방법은 감도가 Kjeldahl법의 104배, 중질소법의 103배 높으며 간단, 신속히 측정할 수 있고 중질소법에 비해 경제적 이점이 있다. 그 반면에 이 방법은 간접측정법으로서 질소고정량을 정량적으로 측정하는 경우에는 공시 시료의 질소고정 효소계의 아세틸렌 환원법과 중질소법에서 측정된 질소고정량과의 정확한 비율을 알 필요가 있다. 이론으로는 다음 반응과 같으며 같은 양의 환원물질공급으로 3몰의 아세틸렌이 환원되는데 대하여 1몰의 질소분자가 환원되어 환산비의 이론치는 3:1(C2H2 - N2)이다.

3C2H2    +   6H+   +   6e-   -----→  3C2H4

   N2      +   6H+   +   6e-   -----→   2NH3

연구자에 따라 반응물질 대신에 생성물질 3몰의 에틸렌과 2몰의 암모니아의 비율을 사용하여 환산비의 이론치를 1.5:1(C2H4 - NH3)로 하여 이용하고 있다.

전자의 경우 환원된 아세틸렌과 생성된 에틸렌은 같은 양이므로 3:1의 비율은 실제 측정하는 에틸렌의 양과 질소분자와의 비율로서 이용해도 좋다. 아세틸렌은 인화폭발하기 쉬우므로 세심한 주의가 필요하며, 아세틸렌의 에틸렌으로의 환원작용이 질소고정 효소계 이외의 대사에 존재할 수 있다는 것이 이 방법의 불리한 점이기도 하다.

그러나 현재까지 이 반응이 질소고정 효소계 이외에서 검출된다는 보고가 없으므로 아세틸렌 환원법은 생물권의 질소고정 효소계의 검출 및 질소고정능의 측정에 좋은 방법이라고 생각하여도 좋다.

1. 시료의 채취와 조제

토양을 시료로 하는 경우에는 자연상태로 채취하여 균일하게 혼합하여 10∼20g을 삼각플라스크 등에 넣고 측정하거나 그 밖의 시료에 대해서는 적합한 용기를 이용하여(가지달린 플라스크 혹은 시험관 등) 측정에 사용한다.

2. 기상 조작

밭 토양시료는 보통 산소 20%, 탄산 가스 0.04%, 아세틸렌 10%와 아르곤 가스 69.96%의 가스조성으로 1기압으로 하여 배양한다. 아르곤 대신에 헬륨을 사용하기도 하지만 아르곤이 널리 사용되고 있다. 아르곤은 보통 가장 나중에 용기내부를 1기압으로 조절할 때 주입한다. 아세틸렌은 작은 배양용기를 사용할 때는 주사기를 사용하여 용기내부의 기상을 치환 주입한다.

물론 이러한 가스조성은 실험목적에 따라 다르며, 그 목적에 맞게 산소나 아르곤의 비율을 변화하는 것이 필요하다. 예를 들어, 혐기성 아세틸렌 환원능을 측정하는 경우에는 산소를 제거하고 그 양만큼 아르곤으로 치환된다. 근권토양이나 미생물일때는 산소농도가 기상의 수 % 이상이어야 아세틸렌 환원능이 최고가 된다는 보고도 있어, 시료에 관한 최적의 기상을 알 필요가 있다.

절소고정균의 아세틸렌의 포화농도는 0.025부터 0.1기압 사이에 있으므로 아세틸렌 환원능 측정에는 아세틸렌의 농도가 가상의 5∼10%가 되게 한다. 아세틸렌 가스는 고순도의 것이라 해도 acetone을 함유하는 것이 있으므로 진한 황산이 들어있는 가스흡입병에 통과시켜 사용한다. 한편 아세틸렌 가스통은 불순물로서 소량의 에틸렌을 함유하기도 하므로 반드시 같은 기상상태하에서 시료를 포함하지 않은 blank를 두어 그 에틸렌 양을 시료의 에틸렌 양에서 감한다. 또는 아세틸렌가스를 사용 전에 에틸렌 흡수제인 과염소산 수은 용액에 통과시켜 사용한다. 아세틸렌은 인화력이 강하므로 반드시 화기를 엄금시켜야 한다.

3. 배양조작

배양온도는 목적에 따라 다르지만 25∼30℃에서 행한다. 조류나 광합성 세균의 아세틸렌 환원능을 측정할때는, 지상부의 광합성 작용에 따른 영향을 고려하여 지상부를 광조건하에서 배양할 필요가 있다.

배양시간은 10분 내지 수 분내에, 분리균이나 토양은 수 시간이내에 기상의 에틸렌 분석을 한다.

공시시료에 관해 경시적으로 아세틸렌 환원능을 측정하여 배양시간과 활성과의 사이에 직선적 상관관계가 있는지를 검토하고, 그 상관이 인정되어지는 시간내에 측정한다.

토양과 같은 자연의 복잡한 계의 아세틸렌 환원능을 측정하는 경우, 토양내의 수 많은 요인이 영향을 끼칠 가능성이 있으므로 세심한 주의가 필요하다. 토양시료의 아세틸렌 환원능 측정에서 일반적으로 5시간 동안은 배양시간과 아세틸렌 환원능간에 직선적인 상관관계가 있다고 보고되고 있다. 그러나 24시간 이상 배양할 때 비정상적인 높은 환원능이 측정되기도 하는데 이는 2차적인 요인에 의해 얻어지는 결과일 수도 있으므로 주의할 필요가 있다.

4. 분석용 가스 채취

시료를 일정시간 배양한 후, 배양기내의 기상의 일부를 가스분석용주사기(gas tight syringe)로 채취한다. 정성분석에서는 임의의 양으로도 좋지만 정량분석에는 반드시 정확한 량을 채취하여야 한다. 채취량은 경우에 따라 조절할 수도 있지만 보통 가스 크로마토그래피에 의한 가스 분석 시 1회의 주입량을 0.1㎖내지 1㎖로, 1㎖ 정량의 주사기가 사용된다. 주사기를 오랜 시간 사용하면 가스누출이 생기므로 검사를 한 후 사용한다.

시료의 수가 많거나 그 외의 이유로 직접 분석할 수 없을 때에는 0.5 내지 1㎖의 50% trichloro acetic acid나 2㎖의 2.5M 황산 등을 주사기로 주입하여 반응을 정지시키기도 한다. 이 때는 반드시 시약과 시료간에 화학적으로 에틸렌의 생성유무를 미리 확인할 필요가 있다.

5. 가스 크로마토그래피의 조건

아세틸렌 환원법에는 반응생성물인 에틸렌을 가스크로마토그래피로 분석하는 것이 보통이다. Column으로 특별히 정해진 것은 없지만 일반적으로 유리관 및 스테인레스관 등을 사용한다. Column 길이는 1.83m, 직경이 3.2mm 인 것이 가장 편리하다. Column 충진제(packing material) 또는 고정상(stationary phase)으로는 porapak R이 가장 많이 사용된다. 새로이 조제하여 충진된 Column은 사용 전에 충진제 사용한계 이하의 온도에서 수 시간 이상 Carrier gas를 유입시키며 가열한 후 사용한다. Carrier gas로는 질소, 헬륨가스가 일반적으로 사용된다.

Column온도는 porapak의 경우 보통 50℃ 전후에서 사용한다.

검출기(Detector)는 수소 이온화 측정기(hydrogen ionization detector)이며, 검출기 온도 및 시료주입구(injector)의 온도는 Column 온도보다 약간 높은 것(80℃)이 보통이다. 이상의 조건으로 가스를 주입하면 수 분 이내에 아세틸렌과 에틸렌의 분리된 peak가 나타나게 된다.

6. 에틸렌의 검량

여러 농도의 표준 에틸렌 가스를 조제하여 일정량을 가스크로마토그래피에 주입한 후 나타난 peak 높이를 측정하여 표준 검량선을 작성한다. 가스정량은 그 때의 대기압과 온도에 따라 변하므로 반드시 분석시의 대기압과 온도를 정확히 기록한다. 대기압은 기압계의 수은주 높이(mm), 기온은 한난계(℃)로 읽으며 에틸렌 가스 1ℓ중의 몰수를 계산한다.

 

이 식은 P는 압력으로 수은주 높이(mm)이고 T는 절대온도로 온도(℃) + 273으로 표시한다. 예로서 대기압이 750 mmHg이며 온도가 30℃일때 1ℓ의 에틸렌 가스는 0.03969 M로서 1㎖(cc)에는 0.03969 mM, 1㎕에는 0.03969 μM을 함유하고 있다.

7. 질소고정량으로의 환산

공중질소고정효소는 이론적으로 3몰의 아세틸렌을 에틸렌으로 환원할 때 질소가스 1몰이 환원되어 암모니아가 된다. 이론치 3 : 1(C2H2 : N2)를 공시시료의 공중질소고정효소계에 적용할 때 토양 1g이 하루에 1.5 nanoM의 아세틸렌을 에틸렌으로 환원된다면 1년간 1ha당 고정되는 량은

 

1몰의 질소분자량은 28이고, nano mole일 경우 109으로 나눌 필요가 있다. 1ha의 토양중량이 2 Ⅹ 109g, 일년은 365일로서 위와 같이 10.22kg의 질소가 1ha의 밭에서 고정된다.




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