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효소enzyme 토양미생물은 유기태 질소, 인, 황 등을 무기화하며 유기물을 특별한 형태의 유기물로 변화
2013-08-22 17:37:45
이엠생명과학연구원

무기원소 순환에 관여하는 미생물

 

   토양미생물은 유기태 질소, 인, 황 등을 무기화하며 유기물을 특별한 형태의 유기물로 변화(예 : 다당류로부터 단당류를 생성 또는 그 반대), 무기물을 다른 형태의 무기물로 변화시키는 작용과 특히 무기물의 유기화(예 : N2고정) 등의 토양 중 양분변화와 밀접한 관계를 갖는다. 여기에서는 무기물을 다른 무기물로 변화시키는 몇 가지 미생물의 계수와 분석방법을 다루기로 한다.

질산화, 탈질, 유황의 산화, 유산의 환원, 철의 산화.환원, 망간의 산화.환원 등은 토양경제에 있어 상당히 중요하고 그 반응은 토양미생물 중의 일부가 담당하고 있다. 질산화균, 탈질균의 일부, 유황세균, 유산환원균, 철산화균의 일부는 화학무기영양세균으로 불리워진다. 유기영양미생물은 유기물의 산화과정에서 생체에 필요한 자유에너지를 획득하는데, 반대로 이들을 무기물의 산화과정에 의존한다. 자유에너지의 획득반응에서는 부가적으로 유기물의 필요한 형태변화가 생기는데 예를 들면 질산화균은 NH4+ 또는 NO2-를 각각 NO2-, NO3-로 산화하고 철산화세균인 Thibacollus ferrooxians는 Fe2+를 Fe3+로 산화하는 과정에서 자유에너지를 얻고 있다. 또한 유산환원균이나 탈질균의 일종인 Thiobacillus denitrificons는 H2 또는 무기유황화합물을 산화하여 그 과정에서 방출되는 전자로 SO42-를 S2-로 또는 NO3-를 N2-로 환원한다. 이와 같이 무기물질의 순환에는 유기영양미생물 뿐 아니라 화학무기영양세균이나 광합성미생물도 관여하고 있다.

 

1. 질산화세균의 계수와 분리

토양 중 질산화작용(nitrification)의 주역은 무기영양성의 질산화세균으로 암모늄이온(NH4+)을 아질산이온(NO2-)으로 산화시키는 암모니아화세균과 아질산이온을 질산이온(NO3-)으로 산화시키는 아질산화세균으로 나뉜다.

Bergery의 분리법에는 암모니아산화세균으로 4속5종, 아질산화세균으로는 3속3종이 기술되어 있다. 이들 질산화세균은 NH4+ 또는 NO2-의 산화로 에너지를 얻고 또한 이산화탄소 고정에 의한 탄소원을 획득하므로 유기영양물은 필요치 않는다.

질산화세균은 증식속도는 토양중의 유기영양세균에 비교하여 늦고(평균세대시간이 적당한 액체배지로 약 10시간, 토양중에서는 30시간 이상), 또한 토양중의 질산화세균수도 유기영양세균에 비하여 다소 적다. 따라서 유기물을 함유한 배지에 토양현탁액을 접종하면 유기영양세균이 급속히 우점하여 질산화균의 계수나 분리가 어렵게 된다. 토양중의 질산화균의 계수 및 분리시 무기영양성을 고려하여 암모늄염 또는 아질산염으로 된 배지액에 토양희석현탁액을 접종하여 배양시켜 유기영양세균의 배양을 되도록 억제시켜 질산화세균을 우점시켜야 한다.

질산화세균의 계수는 집적배양 후 희석빈도법으로 하며 무기배지를 함유한 시험관에 일정한 희석계열의 토양현탁액을 접종, 배양 후 시험관 중에 질산화세균의 생육 유무를 아질산 및 질산의 생성 또는 아질산의 소실을 조사하여 MPN계산법에 의하여 계수한다. 질산화세균의 분리는 무기배지에 집적배양하여 질산화세균을 우점시킨 후 다시 무기배지를 사용하여 분리한다.

1.1 암모니아산화세균의 계수

 

 1.1.1 기구와 시약

1) 배지

암모니아산화세균계수배지(배지18)을 조제하여 3㎖시험관에 분주하고 1기압하에서 15분간 autoclave 살균한다.

2) Griess - llosvay 시약

A) 설파닐산 시약

sulfanilic acid 0.5g을 acetic aicd 20㎖와 증류수 100 ㎖혼합액에 용해시킨 후 여과한다. 이 시약은 어두운 곳에 보관하며 1개월간 안정하다.

B) α - 나프틸아민 시약

α - naphthylamine 0.1g을 증류수 100㎖에 용해하여 냉각시키고 빙초산 300㎖를 가하여 여과한다. 이 시약은 조제 후 1주일 이내에 사용해야 된고 사용직전에 A,B 두 시약을 동량으로 혼합한다

3) 아연분말

  1.1.2 조작

토양현탁액을 만들어 최고희석배율의 희석현탁액(통상10-6)을 1㎖씩 각각 5개의 시험관에 접종한다. 같은 방법으로 낮은 희석배율의 희석현탁액(10-5∼10-6) 1㎖씩을 접종하여 시료 1점 당 25개의 시험관을 접종하고 이 때 2∼3개의 무접종시험관과 함께 28∼30℃로 4주간 배양한다.

배양 후 Griss - llosvary시약 1∼2방울을 시험관에 떨어뜨려 적색 또는 갈색으로 발색되는 것은 암모니아산화세균의 생육에 의한 NO2-의 축적을 의미한다. 2∼3분 후 미발색 시험관에 소량의 아연분말을 가해서 적색으로 산화되는 것은 일단 생성된 NO2-가 공존하는 아질산화세균에 의해 NO3-까지 산화된 것을 의미한다. 발색된 시험관수를 희석 단계별로 기록하여 MPN법으로 시료중의 암모니아산화세균수를 산출한다. 동시에 배양한 무접종시험관에도 Griess - llosvary 시약을 떨어뜨려 질산화세균의 오염 또는 시약이나 기구의 화학적 오염 등을 확인하고 이들의 오염이 없더라도 때로는 공기 중의 아질산에 의한 오염으로 발색될 수 있다. 이런 경우에는 그 색을 대조하여 오염된 것 보다 강하게 발색된 시험관수를 기록한다.

 

1.2 아질산화세균의 계수

  1.2.1 기구와 시약

1) 배지

아질산산화세균계수배지(배지19)를 조제하여 3㎖시험관에 분주하고 1기압하에서 15분간 autoclave 살균한다.

2) Griess - llosvay시약

  1.2.2조작

사용하는 배지를 제외하고 암모니아산화세균의 계수식에 준한다. Griess - llosvay시약을 1∼2방울 떨어뜨려 발색되지 않는 것은 아질산산화세균의 생육에 의해 NO2-가 소멸된 것이므로 무발색시험관을 기록하여 MPN법으로 시료 중 아질산화세균수를 산출한다.

 1.3 아질산화세균의 분리

 

   1.3.1 기구와 시약

1) 배지(분리용)

질산화세균 분리용배지(배지20)의 A, B액을 9 : 1로 혼합하고 0.1N NaOH 로 pH를 8.0∼8.2로 조절한다.

2) 실리카용액

80% SiO2를 함유한 알칼리성 액체실리카용액

3) 4% HCl용액

4) 배지(배양용)

질산화세균 배양배지(배지21)를 조제하고 5% Na2CO3용액으로 pH를 8.0으로 조절한다.

1), 2), 3)을 각각 1기압에서 15분간 autoclave살균한다. 살균된 분리배지 100㎖에 실리카용액 900㎖를 혼합하고 4% HCl 40㎖를 가하여 잘 혼합한다. 살균된 샤아레에 10㎖씩 분주하여 30℃로 보관한다. 약 30분 정도면 고화되고 그 상태로 실리카켈 평판 표면을 약간 건조시킨다. 이 때 pH는 7.2∼7.4가 된다.

    1.3.2 조작

500㎖ 삼각플라스크에 배양용배지 25㎖와 토양 0.1∼0.2g을 접종하여 30℃로 2∼3주간 배양한다. 배양 후 0.2㎖를 실리카겔평판에 L자형 유리봉이나 백금이로 도말한다. 샤아레에 소량의 살균수를 가하고 30℃에서 2∼3주간 배양한다. 실리카겔평판에 형성된 질산화균의 colony를 분리하여 2.5㎖의 배양용 배지에 접종한다. 배양액 중 NO2- 또는 NO3- 생성을 조사하여 활발한 증식이 확인되면 배양액의 일부를 albumin한천배지(배지1), beef extract agar배지(배지23), 토양침출액한천배지(배지22) 등 2∼3종류의 평판배지에 도말하여 배양액 중의 유기영양 미생물의 오염여부를 조사한다.

오염된 경우는 배양액을 백금이로 배양용배지에 재접종하여 오염이 확인되지 않을 때까지 접종배양을 되풀이한다.

 

1.4 유기영양질산화균의 분리

  1.4.1 기구와 시약

1) 배지(분리용)

세균은 배지1, 방선균은 배지9, 사상균은 배지 24를 사용한다.

2) Glucose peptone배지(배지25)

15㎖를 100㎖ 삼각플라스크에 분주하여 0.4기압으로 15분간 autoclave 살균한다.

3) Gtiess - lloscay 시약

4) 페놀황산시약 : diphenylamine 1g을 진한 황산 100㎖에 녹이고 이것에 주의해서 증류수 20㎖에 희석한다.

5) 활성탄

6) 과산화수소수

  1.4.2 조작

순수분리된 균주를 분리에 사용했던 동일 한천배지에 7∼10일간 28℃에서 사면배양한 후 glucose pepton배지에 접종한다. 질산염을 함유한 Czapek - Dox배지 등을 배양배지로 사용한 경우는 사면에서 균을 분리하여 접종시킬 때 배지도 함께 떼어 넣지 않도록 주의해야 한다. 28℃에서 14일간 정치배양 후 원심분리하여 균체를 제거한다. 상등액을 활성탄으로 탈색시키고 탈색액의 일부를 Griess - llosvy시약으로 NO2-를 정량한다. 그리고 탈색액의 나머지는 NO3-를 정량하지만 NO2-의 생성이 확인되는 경우 과산화수소수를 소량 떨어뜨려 NO2-를 NO3-로 산화시킨 후 페놀황산시약으로 NO2- + NO3- 를 정량한다. 즉 대조로 glucose pepton배지에서 glucose를 제거한 배지를 무접종 상태로 배양하여 NO2- 및 NO3-를 정량한 측정치로부터 차이를 구한다.

  1.4.3 문제점

1) 무기영양질산산화균을 계수할 때 다량의 시험관을 면전, 접종해야 하는 번거로움이 있다. 많은 토양시료를 동시에 계수하는 경우에는 동일규격의 시험관을 100 내지 150공의 시험관꽂이에 준비하여 시험관입구 전체를 한 장의 gauze로 싸고 그 위에 압축된 두께4cm의 솜으로 덮으면 다수의 시료를 신속히 처리할 수 있다.

2) 무기영양성의 질산화세균을 분리시 실리카겔을 사용하지 않는 방법으로 질산화세균을 집적배양액으로 계속 희석시켜 결국 희석현탁액속에 질산화세균이 0∼1세포만 분포하도록 한다. 이렇게 한 현탁액을 다수의 시험관배지 속에 접종, 배양한 후 질산화세균의 생육이 확인되고 유기영양미생물이 생육되지 않은 시험관을 질산화세균만 포함된 것으로 본다.

3) 유기영양성의 질산화세균을 분리하는데는 수백 균주를 시험할 필요가 있다.

탈질균 및 질산환원균의 계수와 분리시 토양 중 미생물의 대부분은 질산이온(NO3-)을 환원하여 질소를 균체구성성분으로 이용하는데 이 반응을 질소동화라고 한다. 이 때 질소는 형태가 변화되었으나, 토양 중의 전체 질소량은 같다. 그러나 어떤 조건에서는 화학반응이나 일부 세균에 의하여 질산은 질소가스(N2)나 아산화질소(N2O)와 같은 기체로 토양으로부터 휘산된다. 이러한 탈질작용이 세균에 의한 경우 그것은 호흡에 필요한 질소의 역할을 NO3-가 대신하는 “질산호흡”이라는 반응에 의한 것이다. 즉 기질의 산화에 의해 방출된 전자는 호흡에서는 최종적으로 산소에 전달되지만 “질산호흡”에서는 산소 대신에 NO3-에 전달되어 NO3-가 N2 또는 N2O가 되는 것이다. 무기영양세균의 일부도 탈질능을 가지고 있는 세균이 있으나 토양 중 탈질세균(denitrification bacteria)의 대부분은 Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter, Micrococcus 이다. 이들 세균은 질소를 이용하여 호기적으로 생활할 수 있고 , NO3-가 있으면 혐기적으로 생활할 수 있다. 산소와 NO3-가 공존하는 경우는 산소를 우선적으로 이용하여 탈질작용은 일어나지 않는다. 탈질균 및 질산환원균은 질소의 형태변화나 그에 부가되는 반응으로 세균의 생육을 확인하지 않고 MPN법으로 계수한다.  




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