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효소enzyme Antisense stategy
2013-08-23 10:23:12
이엠생명과학연구원

1) Antisense stategy

(1) antisense 올리고뉴클레오티드

유전자를 구성하는 이중나선인 DNA는 2개의 맞물린 가닥으로 되어있다. 이중에서 한 개의 가닥만이 의미가 있는 유전정보를 갖고 있어 이를테면 '센스'가 있다. 다른 하나인 '안티센스" 가닥은 분자의 경상(mirror image)으로서 센서 가닥과는 거꾸로 된 메시지를 운반하지만 이를 사용하지 않는다. 유전자가 제기능을 발휘하려면 갖고있는 정보를 단백질로 전환해야한다. 이과정에서 먼저 DNA의 '센스' 가닥을 본떠서 이른바 메신저 RNA 분자를 복사하여 세포핵으로부터 세포의 주체 부분으로 옮긴뒤에 단백질로 전환한다. RNA는 DNA와 달리 보통 가닥이 한 개이다. 이염기들은 고도의 특수한 방법으로 서로 짝짓기를 좋아한다. DNA에서는 이 짝짓기를 통해 2개의 가닥이 함께 꼬여 이중 나선을 구성하고 있다. 그러나 RNA에서는 분자 스스로 꼬여서 투박한 매듭을 만든다. 바로 이것이 '안티센스' 기술의 열쇠가 된다. 메신저 RNA의 경상인 안티센스 DNA, RNA를 세포에 주입하면 메신저 RNA와 단단히 결합하여 메신저 RNA가 단백질로 전환되는 것을 막아버린다. 즉 유전자의 기능의 방해(pertubation)는 RNA의 이용을 못하게 하는 전사후 수준에서 영향을 미친다. 이를 'antisense 전략'이라 한다. 이방법은 전령 RNA의 염기서열은 결국 단백질의 아미노산 서열이 되므로 이를 sense서열 이라 부른다. 이러한 sense서열과 결합하는 서열은 이와 상보적이어야하며 그런 의미에서 그것을 'antisense'서열이라고 한다. 그런 이유로 올리고 뉴클레오티드를 써서 번역과정을 방해하는 방식을 말한다.

발암 유전자의 표현을 억제하기 위한 합성 antisense 올리고뉴클레오티드는 타겟 설정과 제작의 용이성 때문에 antisense 전략의 연구중에서 가장 많이 사용되고 있는 방법이다. 이들의 작용기작은 다음과 같다.

리보조옴이 전령 RNA를 따라 이동하면서 단백질을 만드는 소위 번역과정이 진행된다(a). antisense 올리고뉴클레오티드가 전령 RNA에 결합하면 적어도 두가지 작용에 의하여 번역 과정을 방해한다. 리보조옴의 이동을 막을 수 있고(b), ribonuclease H라는 RNA 분해효소를 활성화시켜 약제가 결합된 부위에서 RNA를 절단할 수도 있다. 절단된 RNA는 번역과정에 쓰이지 못하고 세포안에서 빠른 속도로 분해된다.

만약 antisense 올리고뉴클레오티드(이하 ODNs)를 생체치료에 사용하려면 세포외와 세포내의 안정성 및 세포내 유입에 대한 언급이 필요하다.

변형되지 않은 phosphodiester 결합을 가진 DNA는 혈장내에 많고 세포내에도 많이 발견되는 3'와 5' exonuclease에 쉽게 공격을 받는다. 더우기 세포내로 유입된 phosphodiester의 세포내의 반감기는 아주 짧다(t1/2 < 1h).

그러므로 올리고뉴클레오티드의 5'와 3' 끝에 capping를 하거나 유도체를 ?-로부터 ?-anomeric 형태로 염기배당 결합을 변화시키므로 exonu- clease공격을 방지하거나, 염기들사이의 phospho- diester결합을 변형시키므로 그들의 생존을 증가 시켰다. 이와같이 여러 가지 변형으로 제1세대 modification antisense 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 아마 이들중 가장 많이 사용되는 두개는 methyl-phosphonates(CH3-O-P-)와 phosphorothioates(S-O-P-)이다.

Methyl-phosphonates는 핵산 분해효소에 저항력이 매우 강하며 높은 융해점에서 RNA-DNA 하이브리드를 쉽게 형성한다. 그러나 이들은 덜 특이적으로 결합되거나 단백질과 상호작용을 한다. 이는 아마 중성극 때문으로 사료되며, 이온화되는 수소이온의 부족이 비교적 물에 잘녹지 않으며 더우기 RNase H와 결합할 수 없으므로 유전자 발현을 방해 하기 위한 중요한 기전을 나타내지 못한다.

Phosphorothioates 역시 핵산분해효소에 아주 안정하지만 methyl-phosphonates에 비교해 그들의 극성을 보유하고 있어 물에 잘녹고 RNase H와도 잘 결합한다. 합성하는데 간단하고 쉽고, 값이 비싸지 않고, Tm치가 낮으며 많은 종류의 세포에 이용할 수 있다는 장점이 있다.

올리고뉴클레오티드가 세포로 유입되는 정확한 기전은 아직 확실하지 않지만 한동안은 올리고뉴클레오티드의 큰 크기나 ployanionic charge가 올리고뉴클레오티드의 유입을 방해한다고 믿었으나, 그러나 지금은 변형된 올리고체나 변형되지 않은 올리고체든 생각보다는 쉽게 세포안으로 들어갈 수 있다고 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 항상 주어진 양의 흡수율은 극히 소량이었다. 일단 세포표면에 결합되면 올리고뉴클레오티드는 endo- cytosis나 pinocytosis과정을 거쳐 세포내로 들어간다. 이 과정중 세포막은 물질들을 둘러싸고 endosome이라는 작은 vesicle을 만들어 세포질 내로 들여보낸다. 그러나 이러한 endosome안의 내용물이 얼마나 빨리 세포질로 방출되는지는 아직 분명치 않다.

최근에 시도되는 제2세대 올리고체의 변형 방법으로는 같은 분자에서 backbone를 변형시키거나 정상 디에스터결합을 가진, 혹은 PS-와 PO- 하이브리드분자를 합성하기도하며, 분자의 ribose-phosphodiester backbone을 peptide nucleic acid(PNAS)로 치환하여 아주 안정하고, RNA에 잘 결합하며, 쉽게 합성할 수도 있고 , cell-free systems에서 좋은 결과를 보였으나 불행스럽게도 그들은 세포내로 모두 들어갈 능력이 없는 것 같아 반드시 현미주사를 이용해야만 가능한 단점이 있다. 또다른 흥미를 끄는 전략은 2'-OH위치에 있는 리보오스당을 2'-O-methyl 혹은 2'-O-allyl당 형태로 변형시키거나 heterocyclic bases로 변형시켜 좋은 결과를 얻었다.

또 다른 방법으로는 poly(L-lysine), acridine, 콜레스테롤, poly(rA), 그리고 transferrin과 같은 합성 폴리최타이드와 올리고머(oligomer)을 결합시켰다. 그외 양이온 지질(liposome)내로 피낭를 형성시켜 세포내로 전달방법을 연구하였고 최근에는 특이세포를 표적으로하는 단일항체를 이용한 지질체를 이용하기도 하였다. 또 그외에는 산성상태에서 활성화되는 endoosmolytic activity를 가진 바이러스나 바이러스 단백과 올리고뉴클레오티드을 연결하는 방법으로 acidified endosome으로 올리고뉴클레오티드를 유리시키는 것을 증가시켰다. Morishita등은 불활성화된 hemagglutination바이러스의 단백층과 PS-ODN를 융합시켜 투여시 다른 방법들에 비해 흡수를 10배이상 증가를 보고하였다. 이와같이 antisense 올리고뉴클레오티드가 세포내로 흡수가 잘되고, 매우 안정하고 결합능력의 효과를 높이기 위한 많은 연구가 노력중에 있다.

올리고뉴클레오티드을 이용한 치료제는 효과가 높고 독성이 적은 것이 장점이다. 실험 동물에게 올리고뉴클레오티드를 투여 후 나타났던 독성으로는 저혈압의 지속, 일시적인 범혈구 감소증과 혈액응고 장애, 약간의 간효소치 증가, 간, 비장 비대증이 용량과 투여 속도에 의존하여 나타났으나 사람에게 임상투여후에는 아직까지 별다른 독성이 보고 되어 있지 않다는 것이 고무적이다.

치료에 적용하기 위하여 antisense 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적세포로 접근방법은 매우 유용할뿐만 아니라 여러 가지 면에서 좋은 점이 있다. 첫째로 유전자의 기능을 억제하기 위하여 antisense 올리고뉴클레오티드의 사용은 바이러스벡터의 사용으로 유발되는 insertional mutagenesis나 종양 유발과 같은 심한 부작용을 피할 수 있어 안정성이 높고, 둘째는 세포내 전달효과는 표적세포의 감염 효과가 오직 몇%로 나타나는 보통 레트로바이랄 벡터에 비해 훨씬 높은 것으로 나타나며 antisense 올리고뉴클레오티드에 노출된 세포에서 발현을 억제하는 것이 훨씬 높게 나타났다. 마지막으로는 약 제조 과정 면에서 바이러스에 의한 전달 방법의 구성체 보다는 antisense 올리고뉴클레오티드의 일관된 약제를 생산 하는 것이 훨씬 쉽다.

이 방법을 임상에 충분히 활용하기 위하여는 아직도 극복해야할 난관이 많다. 비록 단가는 계속적으로 떨어지고 있지만 아직도 올리고뉴클레오티드의 생산비가 비싸며, 안정성의 문제라든가, 세포내로 대량으로 전달하는 더 나은 방법을 찾아야 하며 약효도 개선되어야 한다. 이러한 목표를 달성하기 위하여 최근에는 제3세대 올리고체의 변형이나 올리고뉴클레오티드를 분자 모델링(molecular-modeling) 기법으로 다자인을 하는등 많은 연구가 진행되고 있다.

 

(2) Expressed antisense vector

실험적으로는 발현되는 RNA에 상보적인 RNA 가닥을 이용하여 유전자의 기능을 억제 시킬 수 있다. 이러한 방법은 현재 식물을 대상으로 많이 사용 되고 있다. 즉 타겟 유전자의 cDNA의 5' 말단 부위 일부를 진핵세포의 유전자 표현 벡터에 역방향으로 clonig하여 타겟 유전자의 전령 RNA와 상보적인 RNA 의 염기서열를 표현 함으로써 특정 유전자의 발현을 억제시키는 방법(그림 2)으로 주로 유전자의 기능의 조사에 많이 쓰여지고 있으며, 본 연구진도 많이 사용하고 있다.

 

 

위와같은 antisense RNA가 자연적으로 실제 세포에서 발견되는데 그 예로는 c-myb, c-myc, DHFR 유전자등이 발견 되었다. 이는 각각의 유전자들의 전령 RNA 양을 조절하는 것으로 추측하고 있으나 이들의 정확한 기전는 아직도 확실하지 않다. 동물세포를 이용하여 c-fos, c-myc, c-myb, c-jun, c-src등을 포함한 많은 발암에 관여하는 전사조절인자, EGF와 같은 여러 가지 성장호르몬, 그들의 수용체에 관한 연구에 antisense RNA를 표현하는 벡터를 많이 사용하고 있으나, 사람에 있어서는 유전자의 발현이 안되는 질환에서의 사용 제한과 특정 유전자의 RNA의 양적 조절이 용이하지 않은 것이 문제점이다.

 

(3) Ribozyme

Ribozyme은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. ribozyme은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다. 여러개의 자가 절단하는 RNA의 염기서열을 비교해보면 공통적인 2차 구조인 "hammerhead" 나 "hairpin"을 발견할 수 있었고, 이는 11-13개의 일정한 뉴클레오티드(5''-GAAAC(N)nGUN(N)nCUGA(N)GA-3')로 구성된 catalytic부분를 둘러싸고 있는 3개의 이중 가닥 stems의 접힘에 의하여 형성된다. 이들의 주요 절단 부위는 GUN triplet의 3' 말단 부위에서 일어난다(N은 A, C, 혹은 U가 될수있다). GUN의 염기서열이 타겟 전령 RNA의 절단부에 있어야 효과적으로 작용한다는 제약이 따른다. 치료 목적의 ribozyme은 발암에 관계된 타겟 유전자의 전령 RNA를 절단, 단백질의 합성을 차단하므로 발암에 관련된 단백질의 발현을 억제한다. 이와같이 ribozyme은 특정한 RNA를 절단할 수있다는 점에서 질병의 원인이 되는 해로운 단백질의 합성을 억제하는 방법으로 개발, 이용되고 있다. ribozyme 치료의 대상은 AIDS와같은 바이러스 감염에 의해 매개되는 질병들과 염색체의 변이 및 전환에 의해서 발생되는 단백질이 세포형질전환과 밀접한 관계를 나타내는 종양, 특히 조혈계 관련 종양들이다. 예를 들면 ribosome 투여시 CML환자에서 특징적으로 발현되는 bcr/abl 융합단백질의 합성이 억제되고, 세포 성장이 억제되었으며, MDR-1의 RNA 전사체를 ribozyme으로 절단시 항암 화학 요법에 대한 민감도가 증가 되었다. ribozyme역시 화학적 합성후 세포내로 전달시키거나 혹은 유전자 표현 벡터를 사용하여 세포내에서 발현 시킬 수 있다. ribozyme은 염기서열내에 RNA 뉴클레오티드를 최소한 일부 포함해야 효과적인 활성을 나타내므로서 합성 ribozyme은 in vitro에서 활성 조사외에는 사람에게 실용적 가치는 낮다. 안정성의 문제점으로 인하여 ribozyme은 주로 벡터로부터 표현되는 RNA형태로 주로 이용되고 있다. 그러나 벡터를 사용한 방법은 expressed antisense 벡터에서 처럼 전사 수준의 향상과 전사의 효과적인 조절이 해결 되어야 할 문제점이다. ribozyme의 장점은 endoribonuclease activity를 가짐으로서 타겟 RNA를 쉽게 절단 할 수 있다는 점이나 단점으로는 ribozyme의 디자인이 매우 어렵다는 것과 RNAse에 의해 쉽게 변성되는 것이다.

최근에는 ribozyme에 의한 변이 RNA를 정상 RNA로 교정하거나, 해로운 RNA를 개조하여 기능을 상실시키고자 하려는 특정 RNA의 염기서열을 개조하고자 하는 새로운 치료법이 시도 되고 있다. 




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