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효소enzyme Triplex strategy
2013-08-23 10:23:31
이엠생명과학연구원

Triplex strategy

 

그외 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전사를 막는 방법으로는 triplex strategy가 있는데 이 경우 이중사슬의 DNA에 올리고뉴클레오티드가 결합하여 삼중사슬이 만들어지기 때문에 그런 이름이 붙여졌다. triplex strategy의 기본 개념은 이미 50년대에 나타났다. Felsenfeld와 Rich는 우라실만을 염기로 갖는 뉴클레오티드를 아데닌 염기만을 갖고있는 핵산과 섞을시 AU 이중나선 뿐만 아니라 AU 이중나선에 우라실 사슬이 결합한 UAU 삼중나선이 존재하는 것을 발견하였다. 그후 chamberlin등은 티민의 폴리뉴클레오티드와 아데닌의 폴리뉴클레오티드가 TAT 삼중나선을 이룰 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나 이러한 여러종류의 삼중 나선들이 그저 흥미있는 현상으로만 인식하였고 더우기 생체내의 유전자는 실험에서 사용되었던 homopolymer가 아니기 때문에 세포내의 실제 유전자들의 발현을 조절하는데 중요성을 알지 못하였다. 1960년대 말, Morgan과 Wells은 티민과 시토신을 갖는 올리고체와 AT, GC 염기쌍을 갖고 있는 이중나선을 섞을? TAT와 GGC unit를 포함하는 삼중구조가 생기는 것을 확인하여 이와같은 삼중나선구조가 실제 유전자에서 일어날수도 있음을 증명하였다. 1980년대 말에 이르러 유전자의 전사과정이 어떻게 조절되는지에 대하여 많은 것을 알게 되었다. 즉 유전자에는 기본적으로 전사 속도를 조절하는 발현 조절부위(control region)과 단백질의 아미노산 순서를 담고 있는 정보 기록부위(coding region) 두가지 요소로 구성 되어 있다. 전사과정에 관여하는 단백질인 여러 전사조절인자가 유전자의 발현 조절부위의 특정한 자리에 결합하여 전사복합체(transcription complex)가 형성되면서 전사과정이 시작된다(a). 그런 결합이 있은 후 이 복합체의 작용으로 RNA 중합효소라는 단백질이 유전자의 정보 기록 부위에 결합하여 그 부위에 기록되어 있는 정보를 전령 RNA의 형태로 복사한다. 대부분의 triplex 올리고뉴클레오티드들은 조절부위의 sense 염기서열를 표적으로 상보적으로 결합하여 triplex helix를 형성하여 RNA 중합효소가 유전자에 결합하는 것이나 전사 단백의 결합을 방해한다(b). 또 유전자의 정보 기록부위를 표적으로 하는 약제들은 전사가 되는 과정의 진행을 방해한다(c).

유전자의 정보기록부위는 단백질이 결합되어 보호되고 있어 triplex 약이 접근하기 어려운데 반해 조절부위의 일부에서는 접근하기가 용이하여 어떤 유전자의 조절부위에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 전사조절 인자들이 결합하는 것을 방해하는 것이 좋은 치료전략으로 생각되었다. 하지만 합성된 올리고뉴클레오티드가 유전자의 특정서열을 인지 할 수 있는가가 필요하였다. Dervan과 Helene의 실험의 결과로 이중나선의 한쪽에 퓨린 염기가, 다른 한쪽에 피리미딘 염기가 풍부 할 때 triplex가 만들어 지는 것을 알게 되었다. 지금에 와서는 올리고뉴클레오티드 모두가 이중나선중 한사슬에만 특히 그 사슬내에 퓨린 염기가 결합하게됨을 알게 되었다.

실제 세포의 연구에서 Helene등은 인터루킨-2 수용체 유전자의 조절부위를 타겟으로 하는 올리고뉴클레오티드가 그 유전자의 발현을 억제하였고, Postel 등은 c-myc유전자를 타겟으로 하여 그 유전자의 발현을 억제 하였고, Ilan등은 IGF-I 유전자 발현을 억제하여 triplex 약을 궁극적으로 환자의 질병의 치료에 사용할 가능성을 보여주었다.

triplex 올리고뉴클레오티드의 장점은 보다 적은 수의 가능한 타겟 세포을 가지는 유전자 발현과정에서 보다 전(more proximate) 단계에서 작용한다는 것이며 단점으로는 생리화학적 작용이 매우 복잡하고, 아직도 작용이 완전히 밝혀져 있지 않았으며, 세포 핵내로의 이동의 어려움, 또한 고농도에서만 작용한다는 점이 단점이다. 더 중요한 제한점은 타겟 DNA의 퓨린이 거의 한가닥에 집중 되어야만 하므로 모든 세포에게는 적용하지 못한다는 점이다.

 

Oncogenic transcription factor regulation strategy

DNA에 축적되어 있는 유전적 정보가 세포의 활동으로 나타나기 위해서는 RNA와 이어서 RNA를 바탕으로한 단백질이 합성되어져야 한다. 고등동물에 있어서 특정세포의 기능은 어떤 유전자를 갖고있는것도 중요하지만, 실제로는 어떤 유전자가 어떻게 발현되는가가 더욱 중요하다. 식물이나 동물은 서로 다른 조직이나 세포에서 특정 유전사의 발현이 고도로 제어 되고 있으며, 이는 세포의 성장, 분화 그리고 세포 기능등을 수행 하고 있다. 조직과 세포의 발현 조절은 DNA로 부터 RNA를 만드는 전사의 조절에 의해서 이루어 지리라고 생각하고 있다. 고등동물에 있어서 이러한 전사에 관련하고 있는 인자를 크게 3가지 군으로 구분하고 있다. 모든 promoter에서 RNA를 합성하는데 필요한 RNA polymerase 와 이와 결합하는 TF II B, TF II F, TF II E, TF II H 등의 general factors 가 첫 번째 군이다. 또다른 upstream factors를 들수 있는데 이군은 TATA 와 CAT 등의 sequence에 결합하는 인자가 여기에 속한다. 모든 promoter는 최소한 위의 sequence box를 함유하게 되며, TATA box에 결합하여 전사에 관여 하는 단백질을 TBP(TATA box binding protein)라고 하며, 전사 단계에서는 TBP-associated factors(TAFs)와 복합체를 이루어서 전사를 하게 된다. 마지막 군으로는 특정 유전자의 발현을 조절하는 inducible factors를 들수있다. 이군에 속하는 전사 조절 인자는 특정의 조직 혹은 시간 별로 합성이 조절 되므로서 전사를 특정하게 조절한다고 할 수 있다. 이군에 속하는 전사 조절인자는 인자별로 특이적으로 결합하는 sequence motif를 갖고 있으며, 호르몬 수용체, Zinc finger, helix-turn-helix, helix-loop-helix 등의 구조를 갖고 있다. 대표적으로는 ETS family, Myb, Myc, Jun, Fos, NF-kB 등과 homeo protein 이 여기에 속한다. 각조직의 세포는 이상의 inducible factors에 의해서 환경이나 시간등의 조절에 따라 특정의 유전자가 발현되며, 이는 세포의 성장, 분화 그리고 세포사 등을 조절되게 된다.

체세포에서 oncogene은 deletion, translocation 과 inversion 등에 의해서 변이가 일어나며, 이러한 oncogene의 구조적인 변화는 세포의 정상적인 성장, 분화 및 세포의 생존에 변화를 주게 되어 암화가 유도 된다고 할 수 있다. 많은 암에서 전사인자의 전이에 의한 유전자의 과잉 발현 및 융합 단백의 형성으로 인해서 암화 과정이 보고 되고 있다. 백혈병에 있어서 TEL-AML 1, Myb, Myc, FUS-erg 그리고 Ewings' sarcoma에서의 EWS-Fli 1과 melanoma와 연부 조직 종양에서 EWS-ATF등이 대표적이라 할수있다. 구조나 변이 혹은 과잉 발현된 transcription factor에 의해서 세포는 비정상적인 전사를 하게 되며, 이는 형질전환으로 연결된다.

여기에서 소개하고자 하는 방법은 transcription factor의 전사시의 기능을 저해하려는 방법이다. 일반적으로 transcription factor는 TBP와 복합체를 이루며, 대체적으로 histon acetyl transferase의 활성을 갖고 있는 CBP라는 전사인자와 결합을 하여 전사를 시작하게 된다. 따라서, oncogenic transcription factor와 CBP와의 결합을 저해 하면 전사는 시작되지 않을것이며, 궁극적으로 oncogene의 기능을 억제하게 된다. 이와같은 저해제로는 우선 결합 motif에 대한 특이적인 peptide 나 변형 단백질을 예로 들수있다. 이를 유전자 치료에 응용하고자 하면, 위와같은 새로운 형태의 단백질을 만든후, 이를 암 세포에 유전자 전이를 통한 치료를 할수 있을 것이라고 사료 된다. 이에대한 연구는 시작에 불과하며, 이를 유전자 치료의 응용은 시간이 필요하겠지만, 최근의 여러 논문이 이러한 연구의 가능성을 보고하고 있다. Li등에 의하면 negative dominant Jun을 keratinocytes에 발현시킨 결과 원래의 Jun 과 Fos의 결합인 AP-1의 전사 기능을 저해시키며, 궁극적으로 암화가 일어나지 않았다고 보고하였다. 이와 유사한 보고로는 Sapi등은 전사인자인 ETS-2에 대한 negative dominant form의 유전자를 breast carcinoma에 발현시킨 결과, 이 세포는 CSF-1 mediated cancer cell인데 이에 대한 pathway 의 기능이 사라지고 세포의 성장과 soft agar forming이 저해되는 걸로 나타났다. 결국 negative dominant ETS-2는 원래의 ETS-2의 기능을 저해하는 것이며, 그 기전으로는 ETS-2가 다른 전사인자와의 결합을 저해하거나 혹은 ETS-2가 직접적으로 DNA에 결합을 저해할 것으로 생각된다. Jun에 대한 negative form도 이와 같은 작용이라고 할수있다. 백혈병에서 과잉 발현되고 있는 전사 조절 인자인 Myb을 예로들면, Myb은 CBP와의 복합체를 이루어 bcl-2를 전사시키는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 과잉 발현의 Myb은 과잉의 bcl-2를 발현시키게 되며, 과잉의 bcl-2는 세포의 apoptosis를 억제시키며, 이로인한 세포의 형질전환을 생각할 수 있다. 그렇다면, bcl-2의 promoter 상에서 Myb과 CBP 의 결합을 저해하는 Myb의 변형 단백질을 생각할 수 있으며, 이로인한 세포내의 bcl-2의 발현억제는 세포의 apoptosis를 유도시킬 수 있으며, 이를 유전자 치료에 응용한다면 Myb에 대한 특이적인 유전자 치료라고 할수있다. 따라서, oncogenic transcription factor의 암화 과정과 연관된 유전자의 promoter상에서 특이적으로 그 기능을 저해하는 것이 이 유전자치료의 장점이라 할수있겠으며, 또한 이에 대한 연구도 필수적이고 향후 새로운 암의 유전자 치료의 하나로서 각광 받을 수 있으리라 사료된다.




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